La recherche clinique par spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse est une technique analytique qui peut fournir des informations à la fois qualitative (structure) et quantitative (la quantité ou la concentration). Au cours des dernières décennies, la source d’ions  électrospray (ESI-MS) a émergé comme une importante technique dans les laboratoires cliniques. Il fournit un outil sensible, robuste et fiable pour la recherche clinique. Elle permet de coupler avec la chromatographie liquide haute performance (HPLC). Ce couplage HPLC/ESI-MS est devenu une technique très puissante, capable d’analyser à la fois les petites et les grosses molécules de polarités différentes dans un échantillon biologique complexe. La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) permet de fragmenter les ions précurseurs en donnant des ions fragments. Ces ions fragments servent à accéder à la structure de la molécule inconnue, ou pour confirmer la présence d’une molécule connue. La spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) est de plus en plus accessible en matière de coût et l’utilisation, elle permet à la spectrométrie de masse d’accéder à une nouvelle dimension, la HRMS permet d’identifier et confirmer les molécules tout en restant sensible.

En recherche clinique, les spectromètres de masse du type MALDITOF/MS sont les plus connus et les plus utilisés, ces spectromètres offrent des spectres de masse haute résolution, la masse précise, son utilisation est assez simple qui ne demande pas beaucoup de connaissances techniques. La source couplage à plasma inductif (ICP) est aussi très utilisée dans la recherche clinique, cette source permet d’analyser les molécules inorganiques, les atomes avec une efficacité d’ionisation proche de 100%.

La puissance de la spectrométrie de masse et le large choix en matière de source d’ionisation et l’analyseur pour adapter à tous types de molécule, font de la spectrométrie de masse un outil incontournable pour la recherche clinique.

La chromatographie liquide/spectrométrie de masse (LC/MS)

Pour séparer les échantillons complexes tels que le sérum ou le plasma, la LC est principalement utilisée, qui offre un couplage en ligne avec la MS. Par exemple, la quantification précise des protéines à faible concentration (ng/mL) est réalisée, en utilisant de manière reproductible la RP-LC pour les peptides cibles, avant les mesures de spectrométrie de masse en mode multi reaction monitoring (MRM)[1]. Par contre, le débit d’analyse réduit est la principale limite en utilisant la LC avec de longs gradients. Une autre option pour des applications cliniques est le couplage de l’électro-capillaire (CE) avec MS qui est le plus souvent utilisé pour les analyses urinaires[2][3]. Pour le diagnostic, la quantification relative de l’excrétion biomarqueur est suffisante pour déterminer le niveau de polypeptides urinaires avant l’analyse de reconnaissance. La quantification ciblée des protéines et des peptides peut être réalisée avec différents types de spectromètres de masse, y compris le MALDI-TOF-MS[4], le piège à ions, simple quadripolaire SM[5], quadripolaire TOF (QTOF), ainsi que les spectromètres de masse de haute résolution (type Orbitrap)[6][7]. Cependant, le plus souvent, l’instrument triple quadripôle (QQQ) est utilisé qui peut être exploité en mode SRM/MRM pour l’analyse multi résiduelles[8]. Avec les spectromètres de masse QQQ modernes, des centaines de peptides peuvent être ciblés simultanément pour la quantification dans le plasma dans un seul passage[9]. La performance du couplage LC/MS est encore améliorée par l’utilisation d’ultra haute performance chromatographie liquide (UHPLC), couplé avec les spectromètres de masse haute résolution (HRMS). La spectrométrie de masse haute résolution offre des spectres de masse haute résolution et la masse précise, elle est aussi plus sensible que la MS/MS, en évitant les étapes d’isolation et fragmentation. De plus les spectromètres de masse haute résolution sont aussi capables de réalisés les MS/MS, qui augmentent leur performance, cependant le cout de ces spectromètres de masse est assez élevé.

MALDI-TOF/MS, Application en microbiologie de routine

Plusieurs laboratoires de microbiologie hospitalière mais aussi d’analyse médicale se sont récemment équipés de MALDITOF-MS, en abandonnant les tests  phénotypiques  classiques.  L’implantation de cette technique ne semble pas poser de problèmes majeurs. Le spectromètre de masse du type MALDI-TOF/MS est très robuste, il ne souffre pas de problème de pollution, les spectres de masse donnent essentiellement des ions simplement chargés qui facilitent l’interprétation. Les spectromètres de masse, grâce au logiciel de pilotage, sont simples à utiliser et leur prise en main par l’ensemble du personnel ne pose pas de problème. Les points les plus délicats sur le plan technique concernent, la calibration chaque jour, et le mélange échantillon/matrice et son dépôt sur la plaque métallique de support. Un excès d’échantillon de même qu’un mauvais dépôt peuvent altérer la qualité du  spectre  et  rendre  l’identification difficile. Une certaine précision est nécessaire afin de ne pas contaminer l’échantillon voisin. Une fois ces paramètres maîtrisés, les performances varient en fonction des espèces. Dans les études en routine, les résultats obtenus avec le pourcentage d’identification correcte au genre des espèces les plus fréquemment isolées varient de 87 %  à 99 %[10][11][12]. Les entérobactéries ne  posent pas de problème majeur avec une identification correcte de l’espèce dans 97 % à 99 % des échantillons selon les études. Un point délicat reste l’identification des Shigella sp. dont les spectres ne sont pas présents dans toutes les bases de données. Parmi les cocci à Gram positif, les streptocoques du groupe mitis sont particulièrement difficiles à identifier et à distinguer de Streptococcus pneumoniae. Une  autre application de cette technologie est l’identification des bactéries directement à partir des prélèvements, soit à partir de flacons d’hémocultures détectés comme positifs[13][14], soit à partir  des urines[15]. Le gain de temps est alors très important pour la mise en route d’une  antibiothérapie. Concernant les hémocultures, les résultats sont obtenus avec les protocoles les plus rapides en une vingtaine de minutes après quelques étapes intermédiaires qui permettent la séparation des globules blancs des globules rouges. Les pourcentages d’identification correcte du genre varient de 72% à 98 %  selon les études. On retrouve les mêmes difficultés d’identification que celles que l’on rencontre lorsqu’on travaille à partir des colonies. Dans le cas des hémocultures polymicrobiennes, les spectres obtenus sont plus difficiles à interpréter et, dans le meilleur des cas, le germe prédominant est identifié. Pour les urines, les résultats sont très encourageants à condition d’avoir un inoculum bactérien supérieur à 105 CFU/mL. La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF s’impose progressivement et massivement dans les laboratoires de microbiologie. Ses atouts sont nombreux, la robustesse, la rapidité et la précision d’identification, prise en main et utilisation aisées, faible coût par échantillon.

L’imagerie par spectrométrie de masse

L’imagerie par spectrométrie de masse (figure 1) permet d’analyser directement les tissus et représenter la distribution des molécules choisies. Deux sources d’ions sont utilisées pour les expériences en imagerie par spectrométrie de masse, la MALDI (Désorption-ionisation laser assistée par matrice) et la SIMS (Spectrométrie de masse à ionisation secondaire). La MALDI est la source d’ions la plus utilisée pour l’imagerie par spectrométrie de masse. La procédure consiste à couper des sections de tissu, d’épaisseur environ 20 μm, à basse température (-15°C) dans un cryostat. Les tissus sont ensuite déposés sur une plaque de verre rendue conductrice par une fine couche de quelques nanomètres d’ITO (un oxyde d’indium et d’étain) ou sur une plaque d’acier inox. Juste avant l’analyse, la plaque est réchauffée à température ambiante et séchée dans un dessiccateur. L’étape la plus importante et délicate pour l’imagerie MALDI est le dépôt de la matrice. Plusieurs techniques peuvent être utilisées, un nébuliseur, un dépôt automatisé de fines gouttelettes par un robot, ou encore le simple dépôt manuellement à la pipette d’une matrice ionique solide spécialement développée pour cet usage. Le nébuliseur conduit à des dépôts relativement homogènes avec des tailles de cristaux de quelques micromètres. Un compromis  doit  être  obtenu  entre la volatilité des solvants et le temps de séchage, pour obtenir une bonne cristallisation à la surface avec une délocalisation minimale des molécules. Les matrices les plus utilisées  sont l’acide α-cyano-4-hydroxycin-namique (CHCA), pour des molécules de poids moléculaire inférieur à  3000  Da, et l’acide  sinapinique  pour les peptides et les protéines.  L’utilisation  d’un  robot  permet  de  déposer des gouttelettes qui ont au minimum un diamètre de 130 μm, distant les unes des autres de 200 μm au minimum, mais la sensibilité obtenue  par cette méthode apparaît bien  meilleure. Enfin, l’utilisation récente de matrices ioniques solides (mélange équimolaire de  CHCA et d’aniline)  simplifie  grandement  l’étape  de dépôt de matrice, puisqu’il suffit de la déposer à la pipette, tout en apportant une amélioration notable de la sensibilité. Sur les spectromètres actuels, la résolution latérale est généralement limitée par la taille du spot laser sur l’échantillon, lequel est d’environ 25-50 micromètres. La résolution latérale est par conséquent limitée à quelques dizaines de micromètres, ce qui est supérieur à la taille de la plupart des cellules. Enfin, plusieurs tirs laser sont nécessaires pour acquérir un spectre représentatif de chaque pixel. Les spectromètres commerciaux sont  équipés d’un laser à N2 (337 nm) ou d’un laser Nd:YAG triplé (352 nm), lesquels fonctionnent respectivement à des fréquences d’impulsions de 20 et 200 Hz. L’acquisition  d’une  image de 100×100 pixels (10 000 spectres) peut donc durer de 10 à 20 heures, voire plus avec un laser fonctionnant à 20 Hz.

Imagerie par maldi tof

Figure 1 : La procédure de l’imagerie par spectrométrie de masse, en suivant la localisation d’une ou des molécules, (image tirés de l’article de Lin et al[16].).

Plusieurs études sur le cancer et les maladies neurodégénératives ont démontré que l’imagerie par MALDI est une technique clé pour l’identification de biomarqueurs, l’évaluation de leur localisation et de validation[17][18][19]. L’utilisation des archives, les tissus en paraffine fixés au formol des départements de pathologie des hôpitaux représente un « Mine d’or » des données existantes[20]. L’application de MALDI MS imagerie aux matériaux archivés pourrait conduire à la création d’une base de données internationale de marqueur de maladie qui faciliterait le développement du diagnostic précoce pour diverses pathologies ainsi que pour l’examen de suivi de la progression de la maladie.

La HPLC-ICP/MS pour la recherche d’oligo-élément

La nécessité de déterminer les espèces (état d’oxydation/forme chimique) des oligo-éléments présents dans l’environnement et les matrices biologiques a augmenté de façon significative en raison de leurs niveaux élevés comme une conséquence directe de l’activité humaine[21]. Il est connu que certains oligo-éléments sont essentiels pour la santé humaine, mais ils peuvent aussi être dangereux à des concentrations élevées[22]. Suite aux études de ces oligo-éléments dans le début des années 60[23], la toxicité de ces derniers peut maintenant être classée en fonction de leurs état d’oxydation, qui ont permis le développement de plusieurs études sur la biologique, l’environnement, la pharmaceutique et les applications cliniques[24][25]. Pour analyser ces éléments, la spectrométrie de masse est la technique la plus adaptée, avec la source ICP/MS qui est spécialement adaptée pour déterminer des molécules inorganiques. Le principe de cette source d’ions consiste à porter les échantillons à la température très élevée (6000°K-10000°K). Les molécules sont désintégrées jusqu’à l’état le plus stable, voire à l’état atomique. De plus cette source est compatible à la chromatographie en phase liquide (LC), ainsi que la chromatographie haute performance (HPLC), permettant d’analyser les échantillons complexes.

En recherche clinique, l’arsenic (As), sélénium (Se) et le mercure (Hg) sont les trois oligo-éléments qui ont fait l’objet d’une discussion analytique et des recherches au cours des trois dernières décennies. Le sélénium (Se) est parmi la liste des oligo-éléments essentiels nécessaires à la régulation des processus métaboliques et la santé. Alors que l’As et la Hg ne sont pas, et ont été le centre de plusieurs études sur la contamination de la nourriture, l’eau et l’environnement. De nombreuses études sur ces oligo-éléments par HPLC-ICP/MS ont été réalisées, permettant de mieux comprendre le rôle et le niveau de toxicité de ces derniers. Delafiori et ses collègues ont résumé les résultats des recherches portées sur ces oligo-éléments par ICP/MS dans un review, qui détaille la technique ICP/MS, la toxicité et la localisation de ces oligo-éléments, les méthodes d’extraction… Les résultats sont aussi résumés dans un tableau (tableau 1).

Tableau 1 : Des études des oligo-éléments par l’ICP/MS
N Analytes ciblées Matrice Phase mobile Type colonne Réf.
4 Se(IV)

Se(VI)

Sérum, l’urine SI: 20 mM NH4HCO2 (pH 3.0) CEC: PRP-X200

(4.1×250 mm, Ha-

milton,Reno,USA)

Kokarnig et al.

(2015)[26]

SeMet,

MeSeCys,

SII: 10mM pyridine (pH2.5) CEC: Ionospher 5C

(3x200mm, Chrom-pack, Middelburg, Netherlands)

TmSe+ SIII: 20 mM malonate (pH9.5) AEC: PRP-X 100

(4.6x150mm, Ha-

milton, Reno, USA)

 

Selenosugar SIV: 20 mM NH4HCO2, 3%MeOH RP: Atlantis C18

(4.1x150mm, Waters, Wexford, Ireland)

2 TmSe+ L’urine HT MP: H2O, 2% MeOH High Temperature:

Hypercarb (4.6 x 100mm, 5 μm) (Thermo Electron

Corporation, Runcorn, UK) (optimal: 80 °C)

Terol et al.

(2015)[27]

Selenosugar RP MP: 20 mM

NH4HCO3, 3% MeOH (pH3)

RP: Atlantis dC18

(4.6x100mm,5 μm)

(Waters Corporation

(Milford, USA)

50 Se(IV), Se(VI),

SeMet

Sérum MP A: 10mM Tris-Ac (pH8.0) AEC: Thermo AG11

(precolumn 4×50 mm) + AS 11

Vinceti et al

(2015)[28]

SeTrxR,

SeCys,

SeGpX,

Sepp,

SeHSA

MP B: A+500mM NH4Ac (pH 8.0) (analytical column

2×250 mm)

5 As(III)

As(V)

AsB

L’urine, plasma AEC: 50 mM (NH4)2CO3 (pH 8.5) AEC: Hamilton PRP X-100 column

(4.6×250 mm,5 μm)

Contreras-Acuña et al.

(2014)[29]

AsC

DMA

TETRA

TMAO

MMA

DMAE

CEC: 20 mM Pyridine(pH2.5) CEC: Supelcosil LC-SCX, (4.6×250 mm, 5 μm)
37 iAs, AsB,

MMA

L’urine AEC: 20 mM NH4H2PO4 (pH 8.5) AEC: Hamilton PRP

X-100 column (4.6 x 150mm)

Molin et al.

(2014)[30]

DMA Plasma CEC: 20 mM Pyridine (pH2.3) CEC: Zorbax 300 SCX (4.6×250 mm)
9 Salive

 

As(III),

As(V),

MMA,

DMA

MMAv

DMAIII

MMTAv

DMTAv

5 mM TEA, 5% MeOH and 3 mM malonic acid (pH5.65) RP: C18ODS-3 (4.6 x 150 mm, 3 μm particle) (Phenomenex, Torrance, CA, USA) Chen et al.

(2013)[31]

8 Plasma

 

Hg(II), EtHg,

MeHg

MeOH:0.5% 2-mercaptoethanol + 0.05% HCO2H), (3 : 97) RP: Brownlee Columns C8

(4.6x33mm,3 mm)

de Souza et al. (2013)[32]
NR Sérum He(II),

MeHg,

Se(IV)

MP A: 0.14% 2-mercaptoethanolin 50 mM NH4Ac (pH4.6) MP B: MeOH RP: Phenomenex Luna C18 (4.6×250 mm,5 mm)

(California, USA)

Moreno et al. (2013)[33]
5095 L’urine As(V),

MMA,

DMA,

AsB

AEC: 20 mM H3PO4 (pH 6.0)

 

AEC: PRP-X100 column

(4.6 mmx150mm, 5 mm) (Hamilton Company, Reno, USA)

Scheer et al.

(2012)[34]

4 Sang As(III),

As(V),

MMAv,

DMAv,

AsB

Lab1: 0.75 mM TBAH, 25mM NH4CO3, 3%  MeOH

 

Lab1: RP: C18 (Ge-

mini-NX, 4.6×250 mm, 5 μm)

Ito et al. (2011)
NR Sérum Se(IV), Se(VI), SeCys, SeMet MP A: 0.5 mM NH4Cit +2% MeOH (pH 3.7)

MP B: 100 mM NH4Cit+2% MeOH (pH 8.0)

AEC: Hamilton PRP-

X100 (250×4 mm)

Hu et al. (2011)
85 Urine As(III),

As(V),

MMAv

DMAv,

AsB

MP A: 2.5 mM NH4CO3

MP B: 50 mM NH4CO3

AEC: Thermo Hy-

PerREZ XP SAX

(50 mm, 8 μm) (Ther-

mo FisherScientific)

Morton et al. (2011)
5 Cheveux Hg(II)

MeHg

EtHg

0.4% l-cysteine, 0.06M NH4Ac, 0.05%

Mercaptoethanol and 5% MeOH

RP: C18(4x150mm, 5 mm) and a pre-column RP18 de Souza et al. (2010)

N : Nombre de patients

Conclusion

À l’heure actuelle, les instruments quadripolaires triples sont des outils les plus utilisés pour l’analyse LC-MS dans les laboratoires cliniques. Les progrès de la technologie triple quadripôle permettent de réaliser de centaines de transitions MRM dans un seul passage LC-MS/MS, ce qui rend cet instrument encore très important dans la recherche clinique. Cependant, cette approche d’analyse présente l’inconvénient majeur pour les analytes non-ciblées. Par conséquent, un procédé de criblage pour les analytes par les spectromètres de masse haute résolution est préférable.

À l’heure actuelle, le triple quadripôle offre la meilleure précision pour la quantification. La nouvelle génération d’analyseurs TOF telle que la QuanTofTM de Waters va certainement marquer un pas en avant dans la quantification. Et la technologie Orbitrap continue à gagner sa part dans les laboratoires cliniques. La technologie HRMS est maintenant prête à entrer dans les laboratoires cliniques pour des applications de dépistage en raison de la baisse des couts à l’achat et à l’entretien, et en raison de leur facilité d’utilisation. Il ne fait aucun doute qu’ils seront aussi des outils précieux pour l’analyse quantitative dans un avenir proche.

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