Orbitrap, principe et utilisations

Orbitrap, principe et utilisations

L’histoire de l’Orbitrap a commencé depuis 1923 où Kindon[1] a présenté le principe de l’Orbitrap dans lequel les ions sont piégés par des champs électrostatiques. À cette époque, il n’était pas destiné à la spectrométrie de masse, mais seulement pour piéger des ions. Les travaux de Dr. Alexander A. Makarov et ses collègues[2],[3] à partir des années 90 ont contribué largement au développement de cette technique, notamment dans la façon d’injecter les ions dans la cellule orbitrap, et la géométrie de l’orbitrap. Il y fallut attendre jusqu’à 2005 pour voir le premier spectromètre de masse Orbitrap commercial, présenté par la société Thermo Fischer. Depuis la première version commerciale, (Orbitrap XL en 2005), de nouvelles versions de spectromètre de masse Orbitrap sont mis sur le marché, ils offrent beaucoup plus de performances, meilleures résolutions, des vitesses d’analyse très rapide…

Principe de l’orbitrap

L’Orbitrap est un piège à ions, dans lequel les ions se mettent dans leurs orbites à la fréquence en fonction de leur masse sur charge (m/z). L’Orbitrap se compose d’une électrode creuse externe et une électrode centrale placée coaxialement, en forme de fuseau (Figure 1), cette dernière est portée à une tension alternative à la polarité opposée aux ions. La forme particulière des électrodes, est en effet inspirée par la forme des champs électriques, les ions sont injectés tangentiellement à ce champ. Comme l’orbitrap est aussi un piège ionique, la stabilité des ions est aussi gouvernée par la solution de l’équation de Mathieu. Le champ électrostatique dans la cellule orbitrap est décrit par l’équation suivante.

 Équation 1 champs électrique orbitrap

Où r et z sont des coordonnés cylindriques, Rm : Rayon caractéristique, R1 : Rayon d’électrode centrale, R2 : Rayon d’électrode creuse, C : Constant, k : Paramètre déterminé par la forme de l’électrode centrale et la tension appliquée.

orbitrap

Figure 1 : Simulation des ions dans l’orbitrap. Figure à partir de l’article : Orbitrap Mass Analyzer – Overview and Applications in Proteomics[4] (pages 16–21) Michaela Scigelova and Alexander Makarov.

Le mouvement des ions dans l’orbitrap adopte une trajectoire spirale autour de l’électrode centrale, il est décomposé en un mouvement circulaire qui n’est pas exploitable, et un mouvement axial, dont la fréquence est exploitée pour mesurer la masse par la transformation de Fourier. Le mouvement axial des ions est complètement indépendant des paramètres initiaux du moment d’injection des ions, il est décrit par l’équation suivante.

 Équation 2mouvement axial orbitrap

Où z0 est l’amplitude axiale initiale. Ez : énergie cinétique initiale selon la direction z et

équation orbitrap

 Équation 3

Selon l’équation 3, la fréquence axiale des ions ne dépend que le m/z. Le mouvement des ions selon l’axe z, génère un courant induit enregistré par le détecteur qui est placé sur les électrodes creuses. L’image du courant induit est un signal transitoire, qui est ensuite transformé en spectre de fréquence par la transformation de Fourier, puis le spectre de fréquence est facilement converti en spectre de m/z par l’équation 3. Pour avoir une idée de l’ordre de fréquence, la fréquence axiale d’un ion m/z 524 est environ 300 kHz, donc à chaque µs, l’ion m/z 524 fait 3 allers-retours le long de l’électrode centrale.

L’injection des ions

Les ions sont injectés dans la cellule orbitrap par parquet, d’où la nécessité d’utiliser un système de stockage d’ions qui sont produits en continu, avant de les envoyer en même temps vers l’orbitrap. L’injection des ions doit être rapide (typiquement <100-200 nanosecondes), la durée d’introduction de chaque population d’ions de m/z donné doit être très courte par rapport à la moitié de l’oscillation axiale correspondante à la population d’ions introduite. Par contre, la durée d’introduction d’ions est encore très longue par rapport à l’oscillation radiales, créant le déphasage des ions de même m/z jusqu’à 50-100 d’oscillations, et qui formera un anneau autour de l’électrode centrale. Le parquet d’ions doit aussi être compact (< quelque mm) pour assurer la cohérence des ions de même m/z selon la direction z. Plusieurs méthodes sont proposées pour injecter rapidement les ions dans l’orbitrap comme l’emploi des lentilles électrostatiques d’accélération[5], ou l’injection axiale à partir d’un piège à ions linéaire[6]. Mais la méthode utilisée dans les appareils commerciaux est l’emploi d’un C-trap, permettant d’injecter les ions radialement afin de minimiser l’énergie cinétique initiale dans la direction z.

Après avoir injecté les ions, on attend les ions perdent leurs cohérences radiales (typiquement 20-100µs après l’injection), dès lors les ions de même m/z forment un anneau autour de l’électrode centrale, de ce fait, l’effet d’oscillation radiale s’annule et l’effet de la charge d’espace est minimisé.

Le C-trap

Le C-trap est un piège à ions courbé en forme de C, il est équipé d’une porte électrostatique et un trap-électrode placé à la fin du C-trap (Figure 2). Les ions produits par la source d’ions en continu, sont d’abord stockés dans un piège linéaire, puis transférés dans le C-trap (le nombre d’ions est entre 20.000 à 2.000.000). Ces ions sont reflétés par le trap-électrode (potentiel appliqué environ 12V-15V), et commencent à perdre l’énergie cinétique par la collision avec le gaz (≈ 1mTorr) dans le C-trap. On applique ensuite un potentiel à la porte électrostatique et le trap-électrode afin de piéger les ions. Les ions sont pulsés vers l’orbitrap à travers un intermédiaire S-shape qui a pour effet d’accélérer et compacter le nouage d’ions. Les ions sont entrés dans l’orbitrap où le voltage de l’électrode centrale a été appliqué auparavant (50-90 µsec), mais il n’atteint pas encore le voltage final (environ 3500 V). Globalement, les ions entrent dans l’orbitrap quand le voltage de l’électrode centrale est en train de ramper, cette technique est appelée « Electrodynamic Squeezing ». En procédant ainsi, le nouage d’ions est compacté, et la rotation des ions est réduite afin d’éviter la collision avec l’électrode creuse, il permet aussi d’injecter une large gamme de m/zmz

schéma d'un spectromètre de masse hybride orbitrap

Figure 2 : Schéma d’un spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Figure à partir de document Thermofisher.

Spectre de masse en tandem

Les spectromètres de masse Orbitrap commerciaux sont souvent des appareils hybrides, c’est-à-dire que l’orbitrap couplé avec les autres analyseurs comme le piège ionique linéaire. La fragmentation est effectuée en dehors de l’orbitrap, puis les ions fragments peuvent être détectés directement à partir de l’analyseur où ils sont produits, ou envoyés dans l’orbitrap pour être analysés en haute résolution.

Il est possible de manipuler les ions dans la cellule orbitrap, éventuellement de les fragmenter. La fragmentation dans l’orbitrap permet d’éviter le transfert des ions fragments, et de profiter le régime de collision à haute énergie (énergie cinétique des ions ≈ 1500eV). Comme l’orbitrap est aussi un piège à ions, il est gouverné par le diagramme de stabilité résultant de la solution de l’équation de Mathieu, les ions à faible qz sont facilement manipulés par une tension alternative. En choisissant un courant alternatif à la fréquence correspondante des ions de m/z donné, on peut éjecter ces ions, un balayage de fréquences peut éjecter tous les ions. Comme le piège 3 D, en omettant la fréquence des ions d’intérêts on peut les isoler, puis les ions précurseurs sont excités afin de se fragmenter. Hu et al[7] ont montré que les ions dans l’orbitrap sont manipulables, ils peuvent être désexcités en appliquant la radiofréquence résonnante déphasée de 180° par rapport aux ions d’intérêt, en appliquant cette radiofréquence déphasée, le pic m/z correspondant aux ions désexcités est disparu dans le spectre de masse, et il est ensuite réapparu une fois qu’on applique la même radiofréquence en phase pour re-exciter ces ions. Cette technique peut être appliquée pour fragmenter les ions, en les désexcitant afin que les ions soient presque stationnaires dans la direction z, et leurs positions sont à z=0, à ce stade on peut appliquer les méthodes de fragmentation classiques comme, CID, IRMPD, Black body… Par contre cette technique comporte des inconvénients importants, d’abord, la désexcitation est lente, puis les ions fragments ont leurs propres énergies cinétiques libérées à partir de la fragmentation dans des directions différentes, ce phénomène contribue à élargir le nouage d’ions, par conséquent les ions ne sont plus en mouvement cohérent axialement, et il est impossible de les désexciter en même temps. À ce jour, aucun spectromètre type orbitrap ne propose la fragmentation directe dans l’orbitrap.

fragmentation dans l'orbitrap

Figure 3 : Illustration d’une séquence de fragmentation dans l’orbitrap, (a) application une fréquence résonnante déphasée 180° (b, c, d)) les ions en position z = 0 peuvent se fragmenter par des méthodes classique (CID, IRMPD…) (e) les ré-exciter les ions, (f) enregistrement.

La résolution et la précision en masse.

Le spectromètre de masse type orbitrap offre de très haute résolution, ils n’ont pas encore dépassé le fameux FT-ICR[8], mais sa résolution est largement suffisante pour des analyses courantes. En comparaison avec le FT-ICR pour un orbitrap classique Makarov et al[9] (2006) ont montré que, pour les ions de m/z 400, quand l’orbitrap atteint une résolution de 60.000, le FT-ICR atteint 100.000, cependant les ions dans le FT-ICR peuvent survivre plus longtemps dans la cellule ICR, permettant d’enregistrer plus longtemps et dépasse la résolution de 100.000, alors que dans l’orbitrap les ions perdent rapidement leurs cohérences, même si on augmente le temps d’enregistrement cela n’a pas d’effet d’augmenter la résolution. Parce que, une fois les ions perdent leur cohérence, le courant induit s’annule.

Mais à haut m/z l’orbitrap est plus avantagé, car la résolution de l’orbitrap est inversement proportionnel à la racine au carré de la masse, d’après l’équation 4, tandis que le FT-ICR est inversement proportionnelle à la masse, donc à partir de m/z ≈ 1100, pour la même durée d’enregistrement (pas très long) l’orbitrap offre une meilleure résolution.

 Équation 4la résolution orbitrap équation

L’amélioration de résolution

On peut améliorer la résolution du FT-ICR en augmentant le champ magnétique (ce qui coute très cher), alors que l’orbitrap peut être amélioré en résolution en augmentant le champ électrique. Bien que cela ne soit pas évident, la relation entre la fréquence d’oscillation axiale et le voltage du courant électrique n’est pas une équation linéaire, d’après l’équation 1, et l’équation 5.

Equation 5fréquence d'ion orbitrap

On peut réécrire

Equation 6fréquence d'ion orbitrap 1

L’équation 6 montre que, la fréquence des ions augmente proportionnelle avec la racine au carré du voltage appliqué, cela permet d’augmenter la vitesse d’analyse et la résolution, en dehors du voltage, la résolution de l’orbitrap peut être améliorée en changeant ratio de rayon des électrodes. En 2008 Malakov et al[10] ont présenté une cellule orbitrap modifiée géométriquement (Figure 4), et le potentiel appliqué est plus élevé (5000V, tandis que celui appliqué à l’orbitrap standard est de 3500V). Avec cette  nouvelle cellule, ils ont montré une augmentation de résolution importante. Pour un scan/s la résolution atteinte environ 120000 (m/z 400), cette résolution est meilleure que le FT-ICT 7 Tesla, mais pas encore dépassée celui à 12 Tesla. Théoriquement ce nouveau orbitrap peut atteindre une résolution de 350.000 pour un ion m/z 524 et plus de 600.000 pour l’ion m/z 195. Ce nouveau orbitrap est introduit dans les nouveaux spectromètres (à partir de l’orbitrap élite) de masse avec un grand succès.

orbitrap modifié

Figure 4 : Comparaison de géométrie entre Orbitrap standard (a) et Orbitrap modifié (b). Figure à partir de l’article Makarov et al 2008.

La précision en masse

La résolution est l’une des critères importants pour avoir la précision en masse, en calibrant interne, les spectromètres de masse type orbitrap dont le pouvoir résolutif est excellent, peuvent avoir une précision <1 ppm. Par contre en calibrant externe, la mesure de masse est moins précise (< 3 ppm) à cause de variation de température. Une solution pour augmenter la précision en masse, consiste à introduire un « lock mass » dans le spectre, c’est en effet un ion de m/z connu avec précision qui est analysé en même temps avec les ions d’intérêt. Par exemple, en protéomique, l’ion m/z 445,120025 est souvent utilisé comme « lock mass », cet ion est formé à partir des molécules siloxanes présent dans l’atmosphère. L’utilisation de « lock mass » permet d’améliorer la précision en masse, sans pour autant d’affecter la vitesse d’analyse. Osen et al[11] ont montré une amélioration de de précision en masse de 3,7 ppm à 0,9 ppm en utilisant un « lock mass ». Un résumé de tous les spectromètres de masse type orbitrap à ce jour, avec leur précision de masse et leur résolution, est présenté dans le tableau 1.

Tableau 1 : La résolution et précision en masse des spectromètres de masse type orbitrap
Type orbitrap Résolution (par défaut m/z 200) Masse precise (Calibration interne)
Exactive Plus Plus de 140.000 < 1 ppm
Exactive Plus EMR Plus de 140.000 < 1 ppm
Q Exactive Focus 70.000 < 1 ppm
Q Exactive 140.000 < 1 ppm
Q Exactive Plus 140.000 < 1 ppm
Q Exactive HF 240.000 < 1 ppm
Q Exactive GC 100.000 (m/z 272) < 1 ppm
LTQ Orbitrap XL Plus de 100.000 (m/z 400) < 1 ppm
Orbitrap Velos Pro Plus de 100.000 (m/z 400) < 1 ppm
Orbitrap Elite Plus de 240.000 (m/z 400) < 1 ppm
Orbitrap Fusion Lumos 500.000 < 1 ppm
Orbitrap Fusion 450.000 < 1 ppm

 

Utilisations de l’orbitrap

Les spectromètres de masse type orbitrap sont utilisés dans plusieurs domaines, grâce à sa haute résolution, sa sensibilité, sa précision en masse… Et ils sont assez simples à utiliser par rapport à FT-ICR. Parmi les domaines d’utilisation de l’orbitrap, on peut citer la protéomique[12] avec les approches topdown, bottom up… La métabolomique, le dopage…Globalement, orbitrap intervient dans presque tous les domaines où la spectrométrie de masse est utilisée.

 

[1] ORBITRAP MASS SPECTROMETRY: INSTRUMENTATION, ION MOTION AND APPLICATIONS Mass Spectrometry Reviews, 2008, 27, 661– 699

[2] Gillig, Bluhm, & Russell, 1996; Makarov, 2000

[3] Makarov A. 1999. Mass spectrometer. US Patent 5,886,346.

[4] Orbitrap mass analyzer–overview and applications in proteomics. Scigelova M1, Makarov A.

[5] Makarov A. 2000. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: A high performance technique of mass analysis. Anal Chem 72:1156–1162.

[6] Hardman M, Makarov AA. 2003. Interfacing the orbitrap mass analyzer to an electrospray ion source. Anal Chem 75:1699–1705.

[7] Q, Makarov AA, Cooks RG, Noll RJ. 2006a. Resonant ac dipolar excitation for ion motion control in the orbitrap  Mass analyzer. J Phys Chem A 110:2682–2689.

[8] Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy  Melvin B. Comisarow, Alan G. Marshall

[9] Makarov A, Denisov E, Kholomeev A, Balschun W, Lange O, Strupat K, Horning S. 2006a. Performance evaluation of a hybrid linear ion trap/

orbitrap mass spectrometer. Anal Chem 78:2113–2120

[10] Performance Evaluation of a High-field Orbitrap Mass Analyzer Alexander Makarov, Eduard Denisov, and Oliver Lange

[11] Olsen JV, de Godoy LMF, Li G, Macek B, Mortensen P, Pesch R, Makarov AA, Lange O, Horning S, Mann M. 2005. Parts per million mass

[12] Macek B, Waanders LF, Olsen JV, Mann M. 2006. Top-down protein sequencing and MS3 on a hybrid linear quadrupole ion trap-orbitrap mass spectrometer. Mol Cell Proteomics 5:949–958.

accuracy on an orbitrap mass spectrometer via lock mass injection into a C-trap. Mol Cell Proteomics 4:2010–2021.

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