Les-methodes-d’activation-dans-la-cellule-ICR

Méthodes d’activations

En plus de la méthode classique d’activation CID dans la cellule de collision hexapolaire, le FTICR offre un grand nombre de mode d’activation qui peuvent soit (i) conduire à un «chauffage lent» de l’ion précurseur (IRMPD, SORI-CID et BIRD) ce qui conduit à la production d’ions par les chemins de plus basse énergie soit (ii) conduire à des décompositions «non ergodiques», due à des processus chimiques, par capture ou détachement d’électrons (ECD, EDD).

 Activations collisionelles

         1.1 Dissociation en régime de basse énergie dans la cellule de collision

La dissociation induite par collision (CID) est un mode d’activation classique et couramment utilisé. Dans un système hybride Qh-FT/ICR,[1] équipé d’un filtre de masse quadripolaire ainsi que d’une cellule de collisions hexapolaire, un ion précurseur peut être sélectionné dans le quadripôle, puis soumis aux collisions avec un gaz inerte comme l’argon. Un transfert d’énergie rapide sur l’ion appartenant à un faisceau d’ions selon une trajectoire imposée par les potentiels externes (source et hexapôle), se fait par conversion de l’énergie cinétique de l’ion en énergie interne vibrationnelle. Notons que l’énergie cinétique des ions est choisie selon la tension de polarisation de l’hexapôle. Lorsque l’énergie interne est supérieure au seuil d’énergie à fournir (énergie d’activation E0 + déplacement cinétique) pour qu’il y ait fragmentation, l’ion précurseur se décompose en ions produits, transmis et analysés dans la cellule ICR. Il faut souligner que cette cellule de collisions fait également office de piège linéaire, où les ions sont accumulés avant d’être transmis vers la cellule ICR permettant d’accroître la sensibilité. Le mode CID a été utilisé pour étudier une grande variété de composés, cependant il est limité pour donner des ions fragments caractéristiques de certaines grosses molécules chargées, e.g., oligonucléotide, oligosaccharide, protéine.

Rappelons ici que la dissociation dans la cellule de collision externe offre de nombreux avantage. Tout d’abord, une augmentation importante de la gamme dynamique de l’instrument. Ainsi, un ion minoritaire peut être sélectionné et lui seul et ses ions produits seront transmis vers la cellule ICR. Par ailleurs ce mode de dissociation permet d’éviter d’avoir à introduire un gaz d’activation dans la cellule ce qui conduirait à une diminution du pouvoir résolutif.

L’inconvénient majeur de ce mode est l’existence éventuelle d’un effet de temps de vol lors de la transmission des ions vers la cellule ICR ce qui peut conduire à une discrimination dans l’abondance des ions selon leur rapport m/z.

2 Activation collisionnelle de basse énergie par excitation résonante ou “presque”

La dissociation sous collisions dans la cellule ICR peut être effectuée de manière résonante par l’introduction d’un gaz de collisions inerte (argon) de manière pulsée dans la cellule ICR (au contraire des collisions axiales du faisceau d’ions dans le cas de CID dans l’hexapôle de collisions). En fait, les ions étant piégés selon des trajectoires de faibles amplitudes, l’excitation collisionnelle de ces ions ne peut se faire qu’en augmentant le rayon de l’orbite des ions tout en évitant leur perte. Dans le mode dit « on resonant » (RE-CID) l’ion précurseur est activé par une radiofréquence correspondant à sa fréquence cyclotronique appliquée pendant un temps très cours (< 500 µs). Le principal inconvénient de ce mode, est que les ions produits sont générés hors axe ce qui conduit en particulier à leur perte d’ions d’où une dégradation de la sensibilité et de la résolution.

Dans le mode d’activation SORI-CID[2] l’ion précurseur est excité à une fréquence légèrement décalée de sa fréquence cyclotronique de 0,5 à 2 kHz. Ainsi, l’ion est alternativement activé et désactivé suivant que la fréquence d’activation est en phase ou en opposition de phase avec la fréquence de l’ion précurseur (Figure 1). Ce mode permet d’utiliser un temps d’activation beaucoup plus long (~250 – 500 ms), ainsi la dissociation peut devenir plus efficace.

a)a b)opposition de phase
Figure 1. (a) A gauche, évolution du rayon cyclotronique des ions  en fonction du temps  (b) A droite déphasage de la fréquence de résonance vis-à-vis de la fréquence des ions.

Quatre paramètres principaux déterminent l’efficacité de la fragmentation en mode SORI-CID: le décalage de fréquence (frequency offset), l’amplitude d’excitation, le temps d’excitation, et la pression du gaz.[3],[4] La fréquence offset et l’amplitude sont à optimiser pour chaque expérience afin d’obtenir un degré de fragmentation satisfaisant. Plus la fréquence offset est petite, plus l’accumulation d’énergie interne de l’ion précurseur est rapide, donc la constante de vitesse des fragmentations augmente. Le mode SORI-CID étant sélectif de l’ion précurseur, les ions produits ne peuvent pas être activés lorsqu’ ils n’ont pas la même fréquence. Les ions consécutifs qui peuvent être observés sont dus à un excès d’énergie transférée à l’ion précurseur.

L’inconvénient des modes SORI-CID et RE-CID est la longueur de la durée d’analyse par rapport aux autres méthodes d’activation comme l’IRMPD (vide infra). En effet, le gaz introduit dans la cellule ICR pour produire les collisions et la fragmentation de l’ion précurseur, provoque une augmentation de la pression à près de 10-6 mbar (au lieu de 10-10 mbar). Par conséquence, la sensibilité et la résolution sont largement dégradées. De plus, cette pression élevée peut conduire à la distorsion du massif isotopique. Il est donc nécessaire après l’étape d’activation de respecter un délai de pompage nécessaire à obtenir à nouveau un vide suffisamment faible (de l’ordre de quelques secondes pour atteindre un vide de 10-9-10-10 mBar) avant d’effectuer l’étape de détection car il est souhaitable d’avoir un signal transitoire plus long. Figure2 démontre les différentes étapes pour une expérience SORI-CID.

 Séquence d’analyse pour obtenir un spectre SORI-CID
Figure 2. Séquence d’analyse pour obtenir un spectre SORI-CID (documentation Bruker)

 Activations photoniques : IRMPD et BIRD

          2.1 IRMPD

Le mode l’IRMPD a été développé à l’origine dans le cas de l’ICR pour la caractérisation structurale de molécules de faible rapport m/z.[5] Dans les années 90, McLafferty et al. a démontré son intérêt pour l’étude de peptides, de protéines, d’oligonucleotides et d’oligosaccharide. Depuis, ce mode d’activation est devenu un outil très utile pour étudier la structure des biomolécules.

L’IRMPD consiste en la dissociation induite par absorption de photons infrarouges, en anglais InfraRed MultiPhoton Dissociation. L’ion précurseur est irradié dans la cellule ICR par un laser IR à CO2max = 10,6 µm) en continue. La durée de l’impulsion du laser et la puissance du faisceau, mesurée en pourcentage de la valeur maximale, sont les deux principaux paramètres à contrôler, puisqu’ils contrôlent la constante de vitesse de l’ion précurseur. L’acquisition d’un spectre MS/MS en mode IRMPD est réalisée en plusieurs étapes successives résumées sur le Figure 3.

 Séquence d’analyse pour obtenir un spectre IRMPD
Figure 3. Séquence d’analyse pour obtenir un spectre IRMPD (documentation Bruker).

Le mode d’activation IRMPD présente l’avantage, par rapport au mode SORI-CID, de ne pas nécessiter l’introduction de gaz. Donc, la résolution est préservée comparé au mode SORI-CID. De plus, le cycle d’analyse est plus court. Cependant, ce mode par irradiation laser n’est pas sélectif à l’ion précurseur, à la différence du mode SORI-CID. En effet, tous les ions dont la trajectoire se superpose a celle du rayon infrarouge peuvent être activés de la même manière. Les ions produits formés lors de la dissociation de l’ion précurseur continue à subir cette activation, conduisant à de nombreuses fragmentations consécutives. Inversement, les ions évoluant sur une orbite plus grande que le rayon du laser IR, ne peuvent pas être activés. C’est souvent le cas lorsque l’approche de piégeage « sidekick » est utilisée. Car cette approche, permet de modifier le mouvement magnétron des ions et peut induire un rayon magnétron trop grand (Figure4a). Afin de résoudre ce problème, une impulsion de radiofréquence peut être utilisée pour augmenter l’efficacité de la dissociation (Figure4b).

 Combinaison du mouvement magnétron et du mouvement cyclotronique d’un ensemble d’ions qui possède

Figure 4. Combinaison du mouvement magnétron et du mouvement cyclotronique d’un ensemble d’ions qui possède une orbite plus grande que le rayon du laser après application du sidekick : (a) sans application d’impulsion radiofréquence, les ions ne sont pas irradiés, (b) après application d’impulsion radiofréquence, les ions sont irradiés.[6]

* Rm : rayon magnétron ;   Rc : rayon cyclotronique

2 BIRD

          Similaire à l’IRMPD, le mode BIRD[7] (Black-body Infrared Dissociation) consiste à activer l’ion précurseur par l’accumulation de l’énergie transmise par des rayonnements infrarouge. Les photons infrarouges sont émis par les parois de la cellule ICR lors qu’elle est chauffée thermiquement. Ce mode d’activation conduit à des décompositions analogues à celles observées sous IRMPD ou SORI, mais il est surtout utilisé pour la détermination d’énergies d’activations de rupture de liaisons covalentes ou non.[8] En effet, en raison du vide poussé existant dans la cellule du FT-ICR ce mode de dissociation implique un échange constant d’énergie entre les ions piégés et leur environnement par absorption et émission de photons infrarouge. Ainsi lorsque le vide est suffisamment poussé (<10-6 mbar) l’échange d’énergie par collision avec le gaz résiduel devient négligeable par rapport à l’absorption et émission de photons IR et cela durant un temps d’observation relativement long (plusieurs secondes). Il est ainsi possible d’appliquer la loi d’Arrhenius et d’estimer pour un processus de dissociation donné l’énergie d’activation Ea ainsi que le facteur préexponentiel A.8

 equation Équation 1

3 Activations chimiques : ECD, EDD et ETD

3.1 ECD

La dissociation par capture d’électron (ECD)[9] a montré son potentiel pour l’étude structurale des biopolymères.Erreur ! Signet non défini. Les ions précurseurs multichargés positifs sont bombardés par des électrons de faible énergie cinétique (< 0.2 eV) ce qui conduira à la capture d’un électron (ou plusieurs) suivi de leur dissociation. Il conduit préférentiellement aux ruptures de liaisons fortes comme S-S et N-Cα, alors que d’autres liaisons fragiles sont conservées. Ce mode de décomposition conduit à des résultats différents des autres modes d’activation, permettant ainsi d’apporter des informations structurales complémentaires. Il a été proposé que l’ECD implique des processus non-ergodique, c’est-à-dire que les décompositions ont lieu avant randomisation de l’énergie, pour rendre compte du caractère aléatoire des décompositions observées.9 Par exemple, dans le cas des peptides, des ions fragments de type c et z• (ou c• et z) sont obtenus par ECD[10] au lieu des ions conventionnels b et y (selon la nomenclature de Roepstorff[11]) observés en général par les modes d’activation vibrationnel comme le CID ou l’IRMPD. En particulier il a été montré que l’ECD permet de dissocier le squelette peptidique tout en préservant des groupes labiles comme des phosphates ou des sucres. En Figure 5, dans le cas d’un peptide glycosilé, le mode IRMPD conduit principalement à des fragmentations de l’oligosaccharide alors que le mode ECD conduit à des clivages du squelette peptidique. Ses principales applications sont : i) le séquençage de-novo des protéines,[12] ii) la localisation des sites de modifications post-traductionnelles.[13]

 Fragmentation de l’ion [M+3H]3+ d’un glycopeptide formé sous electrospray par (a) IRMPD et (b) ECD
Figure 5. Fragmentation de l’ion [M+3H]3+ d’un glycopeptide formé sous electrospray par (a) IRMPD et (b) ECD.[14]

Les mécanismes impliqués dans la dissociation par capture d’électrons sont encore le sujet d’études et de débats[15]. Un cation radical est produit par la recombinaison ion-électron exothermique qui se décompose rapidement. Dans le mécanisme original, l’électron est capturé par le site de protonation qui dans le cas des peptides est souvent la chaîne latérale de la lysine ou de l’arginine. L’attachement de l’électron conduit à la formation d’un radical instable qui se dissocie par perte d’un atome d’hydrogène. Cet hydrogène est capturé par le carbonyle d’une liaison amide proche, conduisant à un intermédiaire qui se dissocie par la rupture de la liaison N-Cα adjacente.10 Plus récemment, Turecek a proposé un autre mécanisme où l’électron est capturé par la liaison amide conduisant à la formation d’une espèce dite « superbase » qui va capturer un proton à partir d’un aminoacide basique proche (Schéma 1).15 Ce mécanisme permet de mieux rendre compte le caractère relativement aléatoire des ruptures observés le long du squelette peptidiques.

 Mécanisme général du processus ECD
Schéma 1. Mécanisme général du processus ECD.15

 

3.2 EDD

En 2001, Zubarev et al. ont introduit le mode EDD[16] (dissociation par détachement d’électron) appliqué sur les anions multichargés. Au contraire de l’ECD, l’ion précurseur subit les bombardements d’électrons de haute énergie cinétique (> 10 eV) afin de détacher un ou plusieurs électrons. Ainsi, dans le cas des peptides,[17] l’espèce oxydée [M-2H]-• conduit principalement à des pertes de CO2 ainsi qu’à des ions de séquence des séries a et x obtenu par la rupture de la liaison Cα-C. Il apparaît que les ions a sont moins abondants que les ions x. Ceci a été expliqué par le caractère instable de ces espèces radicalaires qui peuvent se réarranger rapidement et/ou se fragmenter de façon consécutive.17

 Mécanisme proposé pour la dissociation par détachement d’électron
Schéma 2. Mécanisme proposé pour la dissociation par détachement d’électron.

L’EDD a montré son intérêt pour l’étude des biopolymères présentant des fonctions acides, et en particulier sur les oligonucléotides. Il a été observé que sous EDD, de simples brins d’ADN multidéprotonés de petite taille[18] conduisent aux espèces oxydées qui peuvent dans certains cas se fragmenter pour conduire à des ions de séquence w et (a-B) comme observé sous activation collisionnelle. Cependant, en plus de ces ions, des ions radicalaires a et z ainsi que des ions c, (c-B), x et (x-B) qui semblent être spécifiques de ce mode de fragmentation. Ainsi, il semble que des informations structurales supplémentaires puissent être observées sous EDD.

3.3 ETD

Sur un principe proche de l’ECD, la dissociation par transfert d’électrons ou ETD (electron transfert dissociation) a été développé.[19],[20] Au lieu du bombardement d’électron, un réactif chimique chargé négativement donneur d’électrons est introduit qui réagit avec l’espèce à fragmenter.[21] Il s’agit donc une interaction ion/ion entre l’ion précurseur et le réactif chimique avec lesquels un transfert d’électron a lieu pour produire la dissociation. Dans ce cas le choix du réactif semble être primordial. Ainsi, dans le travail initial de Hunt, l’anthracène a été ionisé dans une source d’ionisation chimique en présence de méthane pour produire des ions réactifs C14H11. McLuckey a utilisé des anions nitrobenzènes21 ou encore des anions radicaux d’azobenzène. Aujourd’hui, le fluoranthène est souvent employé sur des machines commerciales où l’ETD a été implémenté.19,[22] Il faut souligner que l’ETD a été appliqué également avec succès pour la dissociation d’espèces multidéprotonés de façon analogue à l’EDD.[23] L’ETD est ainsi une technique applicable aux ions positifs tout comme ions négatifs en utilisant différents réactifs, mais son application en instrument FT-ICR reste à développer.

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