MALDI (Désorption-ionisation laser assistée par matrice)

La source d’ionisation MALDI est une technique d’ionisation douce permettant d’ioniser les molécules à partir de l’état solide, par conséquent les molécules de hauts poids moléculaires non volatils sont facilement analysées. Cette source d’ionisation est découverte en 1984[1] et elle est contribuée en grande partie par Karas et ses collègues[2]. En 2002 Tanaka et ses collègues ont reçu le prix Nobel pour leurs travaux, en démontrant qu’une protéine pouvait être ionisée par le laser en utilisant une matrice adéquate. Avant MALDI, plusieurs techniques d’ionisation ont été inventées pour accéder à des biomolécules sans grand succès, soit la source est trop énergétique, soit elle n’est pas assez sensible. L’invention des deux sources d’ionisation électrospray et MALDI a changé radicalement la performance de la spectrométrie de masse, notamment dans le domaine de biologie. La source électrospray est sans doute indispensable pour la spectrométrie de masse, dans le domaine de biologie, mais la MALDI est aussi un outil incontournable et très efficace dans ce domaine. Plusieurs méthodes utilisant le laser pour ioniser les molécules ont été inventées comme SALDI[3] ou DIOS[4] mais la sensibilité de ces méthodes est très inférieure par rapport à MALDI, qui dès son invention en 1988 est capable d’analyser une quantité de l’ordre de 1pmol puis quelque femtomole quelques années plus tard. A nos jours, des quantités de l’ordre d’attomole sont souvent atteints par la source MALDI.

Ionisation

Malgré des années de recherches, le processus d’ionisation de MALDI n’est toujours pas complètement élucidé, si l’absorption d’énergie des molécules matrices est facile à comprendre, mais l’ionisation des analystes et la matrice est encore mal connue. On observe dans un spectre MALDI majoritairement des ions précurseurs monochargés, quelques ions multichargés, des ions pseudo-moléculaires cationisés, des ions matrices radicalaires et un peu de l’ion fragments. Le spectre MALDI est assez simple car il est constitué principalement des ions monochargés, mais la présence des autres ions donnant lieu à un nombre important d’hypothèses du processus d’ionisation en MALDI, par contre aucun d’hypothèse n’est capable d’expliquer la formation de tous les ions.

Nous verrons d’abord l’absorption d’énergie laser par la matrice, donc chaque tire laser apporte une quantité importante de photon, ce sont des parquets d’énergie élémentaires donc chaque photon possède d’une quantité d’énergie équivalant à hf, h étant le constant de Plank et f est la fréquence qui est l’inverse de la longueur d’onde du laser.

f = 1/ʎ  équation 1

ʎ : la longueur d’onde.

 D’après l’équation 1, plus la longueur d’onde est courte plus le photon est énergétique. Chaque molécule matrice absorbe la quantité d’énergie différemment selon leur coefficient d’absorption α qui est l’inverse de la profondeur pénétration du laser. Cette profondeur est environ de 20nm à 200nm et la fluence laser (efficacité du laser) est réduite environ 30% par rapport à la surface. Cette profondeur est égale plus ou moins à la profondeur creusée par un tire laser. Si le dépôt matrice/analyste a une épaisseur d’environ 100µm, il peut être analysé au même endroit quelques dizaines de fois, mais en pratique, les tires laser se déplacent pour éviter l’inhomogénéité. Chaque tir laser a une durée de quelques nanosecondes (Laser à l’UV) à quelques microsecondes (Laser à l’IR), apportant une quantité importante de photon. La quantité d’énergie par photon dépend de la longueur d’onde du laser, par exemple, pour le laser à N2 dont la longueur d’onde est 337 nm, chaque photon porte 3,7eV. En MALDI, le laser à N2 est souvent utilisé et considéré comme standard pour le faible cout, mais les autres lasers sont également utilisés, ainsi que le laser à IR lointain, comme le cas du laser à CO2 (10,6 µm). Étonnement, les spectres MALDI à laser UV sont semblables à des spectres MALDI à laser l’IR, bien que la quantité d’énergie apportant par le photon à laser UV soit très supérieure à celui à laser IR. En absorbant une quantité d’énergie très localisée, une grande partie d’énergie transforme en énergie thermique causant la sublimation de la matrice entrainant les analytes dans la phase gazeuse. La première étape du processus d’ionisation concernant l’absorption d’énergie est bien connue et maitrisée, mais la deuxième étape où les ions se forment n’est pas encore élucidée. On peut trouver beaucoup de hypothèse pour expliquer la formation des ions, ci-dessous on verra les hypothèses qui sont les plus connues.

Multiphoton

L’hypothèse la plus connue de l’ionisation en MALDI est l’absorption de multiphoton[5], où la matrice absorbe un photon et passe à un état de transition énergétique, puis elle absorbe un autre photon donnant lieu à la matrice radicalaire chargée, ce qui explique les ions matrices radicalaires observés dans les spectres MALDI. Par contre l’absorption de deux photons n’apporte pas suffisamment d’énergie pour ioniser la molécule matrice, car le potentiel d’ionisation de la matrice (qui n’est pas encore déterminé) est estimé entre 9 et 10 eV. Avec seulement de 2 photons issus du laser à N2 la quantité d’énergie totale est de 7,4 eV ce n’est pas suffisante, et l’absorption plus de 2 photons par une molécule matrice est très peu probable, car en général, le nombre de photons est inférieur à nombre de molécules matrices. De plus, les spectres de masse en MALDI présentent aussi les ions fragments, qui sont issus probablement des ions précurseurs en ayant l’énergie interne surplus après leur ionisation. Cette hypothèse est encore moins probable, pour le laser à l’IR, parce que l’énergie apportée par le photon est trop faible, elle est inférieure de 1 à 2 ordres de magnitude que celle en UV. Même si la durée du tir laser en IR est beaucoup plus longue que celle en UV, mais la possibilité d’absorber plusieurs photons pour avoir suffisamment d’énergie reste peu probable.

ionisation maldi

Proton transfert

La matrice absorbe un photon et passe à l’état d’excitation puis elle interagit avec l’analyte ou une autre molécule matrice, donnant lieu à une matrice déprotonée et l’analyte protonée ou une matrice protonée[6]. Pour aller plus loin dans cette hypothèse, on peut imaginer un couple matrice/analyte qui partage leur proton. L’excitation par le laser donnant lieu à la séparation des molécules, par chance, l’analyte possède un proton en plus (ou un proton en moins pour les ions négatifs) juste avant la séparation.

ionisation maldi 2

Cette hypothèse explique pour les ions positifs mais aussi vrais pour les ions négatifs, mais elle  ne peut expliquer la présence des ions radicalaires, et ainsi que le peu de différences entre des spectres MALDI à l’UV et MALDI à l’IR. De plus l’environnement local de la MALDI est presque inconnu est aussi un facteur qui empêche d’avancer dans cette hypothèse.

Charge résiduelle en phase solide

Karas et ses collègues[7] ont proposé que les protéines qui portent des charges (protonés, ou déprotonés) en solution, mais les charges restent sur la protéine quand le solvant est évaporé. Dans son modèle, ils proposent que les contre-ions soient les matrices anions, ou les trifluroacétates, cette hypothèse est basée sur le pH du cristal matrice, qui n’est pas un pH neutre. En MALDI, le ratio de matrice/analyte est très élevé (d’environ 2-3 ordres de magnitude), une analyte est entourée par plusieurs molécules matrices, donc, le modèle de Karas peut être possible, car en phase solide, c’est la matrice qui solvate les ions et sépare les contre-ions. A l’étape suivante, le modèle propose que la désorption du cristal matrice/analyte entraine la neutralisation des ions, mais quelques ions simplement chargés survie car le processus de neutralisation n’est pas encore terminé. Autrement dit, la séparation de la matrice et l’analyte a lieu avant la neutralisation.

ionisation maldi 3

L’ion simplement chargé est donc un « lucky survivor » (survivant chanceux) du processus de neutralisation. Ce modèle, est utilisable pour expliquer la formation des ions positifs, mais il est aussi vrai pour les ions négatifs. Par contre, le cluster {(M + nH)n+ + (n-1)A}1+ n’a jamais été observé dans les spectres avec les solutions standards. Le modèle de Karas est aussi incomplet, il ne peut pas expliquer la présence des ions radicalaires, ou pourquoi la neutralisation s’arrête à l’état de charge simplement chargé, dans ce cas les états de charge supérieurs à 1 doivent avoir plus ou moins la même probabilité.

Finalement, aucun modèle ne peut expliquer complètement la formation de tous les ions en MALDI, mais on peut imaginer qu’il peut y avoir plusieurs phénomènes qui entrent dans la formation des ions, et les modèles coexistent.

Le choix de la matrice.

Le choix de la matrice est une étape très importante pour les analyses en MALDI, il n’y a pas de matrice qui adapte pour toutes les analytes. Cependant pour être une bonne matrice en général, il faut que la molécule réponde à quelques critères, comme être stabilisée sous vide, avoir une forte absorbance du laser… Comme le processus d’ionisation en MALDI n’est pas bien connu, il n’y a pas règle précise pour choisir la bonne matrice pour telle ou telle analyte, souvent il faut essayer plusieurs matrices avec des ratios matrice/analyte différents afin de trouver la matrice la plus adaptée. Le tableau 1 montre la liste des matrices qui sont souvent utilisées.

Tableau 1 : Listes de matrices les plus utilisées
Composé Abréviation Structure Analyte
Acide α-cyano-4-hydroxycinnamique CHCA  chca Peptide

Hydrate de carbone

Acide sinapique SA  acide sinapinique Protéine, dendrimères, fullerenes
2,4,6-trihydroxyacétophénone THAP  thap Oligonucléotide, hydrate de carbone, glycoprotéine
Acide 2,5-dihydroxybenzoïque DHB  dhb Polymère systhétique polaire, hydrate de carbone
Dithranol DIT  dit Polymère synthétique non polaire, lipide, dendrimères
2,5-dihydroxyacétophénone

 

DHAP

 

Glycoprotéine

 

La préparation d’échantillon.

Plusieurs méthodes de préparation d’échantillon sont décrites dans la littérature, mais deux méthodes qui sont les plus connues, sont les méthodes goutte sèche et sandwich. La méthode goutte sèche est une méthode la plus utilisée, et très facile à mettre en œuvre, il suffit de déposer une goutte de solution contenant la matrice (environ 1-2 microlitres) sur une surface métallique, ensuite on dépose une goutte de solution contenant analyte sur la goulette de matrice, à condition que la solution de matrice ne soit pas séchée. Ou encore on peut mélanger les solutions contenantes la matrice et analyte puis on dépose une goutte sur la surface métallique. La méthode sandwich est bien plus compliquée, d’abord on dépose une goutte de solution contenante la matrice et attendre qu’elle soit séchée, ensuite on dépose une goutte de solution contenante l’analyte et attendre qu’elle sèche et enfin on dépose la dernière couche de matrice. La difficulté de cette méthode c’est le dépôt de solution d’analyte sur la couche matrice (ou inversement), le solvant de la solution déposée sur la couche matrice solubilise localement la matrice, et le mélange devient inhomogène.

La surface métallique est en général hydrophobe pour éviter la diffusion de la goulette sur une grande surface.

Applications

Comme la MALDI est une méthode d’ionisation douce et sensible, elle préserve les molécules intactes du processus d’ionisation, elle est appliquée dans plusieurs domaines, de chimie inorganique, chimie organique, la biologie… En choisissant la bonne matrice et le ratio approprié, on peut analyser presque tous type de molécule. De plus, la préparation rapide sur plusieurs dépôts de la plaque métallique permettant d’analyser un grand nombre d’échantillons différents en un temps très court. Par contre, la MALDI est une technique d’ionisation à partir de la phase solide, il n’est donc pas possible de coupler directement avec la chromatographie en phase liquide ou gazeuse. La MALDI est une méthode d’ionisation douce, mais elle produit aussi des ions fragments, donc elle offre la possibilité de faire la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Les ions produits par MALDI sont en parquets, nécessitant un analyseur capable d’analyser tous les ions en même temps, par conséquent, la MALDI est souvent couplé avec l’analyseur TOF.

Une application très intéressante de la MALDI ce que n’est pas réalisable (ou difficilement) par d’autre techniques d’ionisation c’est l’imagerie MALDI. Cette technique consiste à analyser directement l’échantillon en déplaçant le laser sur plusieurs endroits de l’échantillon. Les spectres de masse permettent d’identifier les molécules présentes sur chaque endroit. Le plus souvent, on utilise cette technique pour analyser les peptides, lipides ou les protéines au sein des tissus. L’avantage de cette technique est de ne pas délocaliser des molécules permettant d’avoir des images en fonction des molécules d’un tissu.

 

[1] M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp. Influence of the wavelength in highirradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Anal. Chem. 1985, 57, 2935–2939.

[2] M. Karas, F. Hillenkamp. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10000 daltons. Anal. Chem. 1988, 60, 2299–2301.

[3] M. Schürenberg, K. Dreisewerd, F. Hillenkamp. Laser desorption/ionization mass spectrometry of peptides and

proteins with particle suspension matrixes. Anal. Chem. 1999, 71, 221–229.

[4] J. Wei, J.M. Buriak, G. Siuzdak. Desorption–ionization mass spectrometry on porous silicon. Nature

1999, 399, 243–246.

[5] Liao, P.–C.; Allison, J. Enhanced detection of peptides in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry through use of charge-localized derivatives. J Mass Spectrom 1995, 30, 511.

[6] Karas, M.; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. Matrixassisted ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds.

Int J Mass Spectrom Ion Proc 1987, 78, 53.

[7] R. Krueger, A. Pfenninger, I. Fournier, M. Glückmann, M. Karas. Analyte incorporation and ionization in matrixassisted laser desorption/ionization visualized by pH indicator molecular probes. Anal. Chem. 2001, 73, 5812–5821.

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