Principe de la source électrospray

Principe de la source électrospray

La source électrospray a été créée en 1984 par Fenn[1] pour appliquer à des composés biologiques d’intérêts médicaux, comme les pesticides, les acides nucléiques et la pénicilline. L’intérêt de cette source est l’absence d’ions fragment des analystes dans le spectre de masse, utilisation simple et rapide qui demande moins d’échantillon. Les ions sont formés à partir de la phase aqueuse, la fragmentation est plus ou moins contrôlée dans la zone entre la sortie du capillaire, skimmer I et skimmer II (ou entre la zone des lentilles électrostatiques). Cette source est une source d’ionisation douce permettant facilement d’observer les ions pseudo-moléculaires, ce qui n’est pas le cas de la source d’ions impact électronique [2]. De plus, certaines liaisons fragiles comme liaison non covalente présentes dans la solution peuvent être préservées par l’utilisation d’électrospray. Un des plus avantages de la source électrospray est le fait, qu’elle forme les ions multichargés permettant de réduire la gamme de masse.

            Depuis l’invention de cette source, les chercheurs n’ont cessé d’améliorer[3] ce mode d’ionisation/désorption, selon les molécules à analyser, la précision en masse requise. Des avancées ont aussi été faites avec le couplage de la source à divers analyseurs (temps de vol TOF, quadripôle, piège ionique, spectromètre à transformée de Fourrier (FT/ICR, Orbitrap), mobilité ionique IMS). Les travaux relatifs à cette source d’ions innovante se voient récompensés en 2002, lorsque Fenn reçoit le Prix Nobel de Chimie.

I – Parcours de l’échantillon de la source à l’analyseur

            L’analyste diluée dans un solvant adéquat est injectée dans le capillaire métallique d’introduction de la source ESI (Figure 1) au moyen d’une seringue, par exemple. Le débit utilisé est de l’ordre de quelque nL/min (nano-spray) à quelques centaines de µL/min et la température imposée au gaz de nébulisation et évaporation se trouve en général entre 30 et 300°C. Notez que ce gaz n’est pas nécessaire si le débit est faible comme dans le cas de nano-spray.

electrospray processus1

Figure 1 : Schéma d’une source électrospray, de la zone de désolvatation, et de la zone de transfert d’ions chargés

            Sous la pression d’un gaz de nébulisation (N2) et éventuellement du gaz arrivant à contre-courant, la solution d’échantillon est vaporisée dans une zone à pression atmosphérique dans laquelle règne un fort champ électrique. Celui-ci résulte d’une différence de potentiel (0,8 à 6kV, ces valeurs sont des valeurs relatives dans les conditions expérimentales pour les sources électrospray à notre connaissance, il n’y a pas de calcul démontrant les limites de voltage) appliquée entre la sortie du capillaire d’introduction et la contre-électrode (Figure 2). C’est dans cette zone que sont produits soit les ions solvatés après désorption, soit des agrégats chargés dont l’état de charge, positif ou négatif, dépend du signe des potentiels appliqués.

            Puis, ce nébulisât chargé atteint une zone de transfert matérialisée par un capillaire de silice dont les extrémités sont métallisées. Ce dernier fait office d’interface entre la zone à pression atmosphérique de la source et la zone suivante, qui se trouve à pression réduite. Dès lors, les ions subissent un gradient de pression entre la sortie du capillaire de transfert jusqu’à la zone de transfert des ions désolvatés.

            Entre le capillaire de transfert et le premier cône (skimmer), une différence de potentiel (ddp), de quelques dizaines de volts, permet d’achever la désolvatation des ions solvatés et des agrégats chargés. En effet, cette ddp accroît la vitesse des ions solvatés qui subissent un grand nombre de collisions (mais selon un libre parcours moyen faible). Cela signifie que, les ions ont peu d’espace pour accélérer par conséquent, les collisions sont peu énergétiques. En général, dans cette zone, les ions ne sont pas totalement libres de solvant, car les collisions sont peu énergétique. Celui-ci peut être éliminé dans une zone de pression plus réduite où les ions sont accélérés avec un libre parcourt moyen plus grand, alors les collisions sont plus dures, éliminant ainsi les dernières molécules de solvant. Par contre une augmentation trop forte de la ddp dans cette région, transfert suffisamment d’énergie interne aux espèces ionisées pouvant provoquer la rupture de liaisons covalentes, et non covalentes. Par conséquent, les ions fragments peuvent être formés dans cette zone.

            Enfin, les ions libres de solvant sont refocalisés au moyen de barres multipolaires afin d’être éjectés de la région de désolvatation de la source vers l’analyseur. Cette géométrie est couramment utilisée pour optimiser la transmission des ions.

II –Principes de l’ionisation/désorption par électronébulisation

   II.1 – Processus d’ionisation/désorption

            L’électronébulisation à pression atmosphérique repose sur une succession de phénomènes physicochimiques. Leur description reste simple.

            Tout d’abord, le champ d’électrique positif (ou négatif) provoque une accumulation de charges négatives (ou positives) à la surface du liquide (Figure 2), par utilisation de l’électrospray, les ions sont déjà formés dans la phase liquide.

electrospray processus

Figure 2 : Principe de l’ionisation/désorption par électronébulisation dans le cas d’une expérience en mode d’ions positifs.

            Sous l’effet des mouvements de ces charges, et la tension de surface, la forme de goulette se déforme jusqu’à prendre la forme d’un cône (nommé cône de taylor). Dès que les pulsions coulombiennes entre charges positives dépassent la tension de surface du liquide, un jet de gouttes chargées est émis à partir de la pointe du cône. Leur diamètre est de l’ordre du micromètre. Il dépend de la valeur du potentiel électrique, du débit de la solution, de la nature du solvant et de la température du gaz N2.

            L’optimisation de chacun de ces paramètres est primordiale pour permettre l’existence de ces gouttes tout en évitant la modification des propriétés des ions et complexes préformés en solution. Elles subissent alors une évaporation partielle du solvant, ce qui concentre les charges. Les forces de répulsion coulombiennes sont toujours en compétition avec les forces de cohésion qui maintiennent la gouttelette. À nouveau, une limite est atteinte (limite de Rayleigh), défini par l’équation suivante.

equation 1

qRayleigh : Charges moyenne de la goutte.       γ: Tension de surface du solvant.

rmax : Rayon de la goulette.                            εo: Permittivité du vide.

            À ce stade, le modèle de production des ions en phase gazeuse le plus connu selon les étapes suivantes est proposé.

            En 1968, Dole et al.[4] présentent un modèle connu sous le nom de théorie de la charge résiduelle (Figure 3). Leur conception du processus de libération des ions en phase gazeuse se base sur une continuité de la fission des gouttelettes en alternance avec l’évaporation du solvant. D’après eux, l’évaporation totale du solvant, à partir de gouttelettes d’un rayon critique de 100 Ǻ, mène à la naissance d’une molécule intacte dépourvu de solvant et chargée {macro-ion [M+nH]n+ dans le cas d’une ionisation positive, où M représente l’analyste}.

evaporation electrospray

 Figure 3 : Schéma relatif à la théorie de charge résiduelle de Dole et al (S représente une molécule solvant)

            Il existe d’autres modèles pour présenter la production des ions, selon ces modèles, les ions soient éjectés à partir des goulettes[5], soit éjectés directement du cône de Taylor[6]

            A ce jour, les modèles n’ont pas été départagés, et restent complémentaires. Néanmoins, la théorie des charges résiduelle et le modèle de l’évaporation ionique sont les mécanismes les plus cités et utilisés, comme le montre la revue de Kebarle et Peschke[7] faisant état des modèles descriptifs du passage des ions de la solution à la phase gazeuse en électrospray. En fait, d’après cette revue, il se pourrait que la combinaison des deux modèles majeurs représente la réalité du phénomène. Dans ce cas, le modèle de l’évaporation ionique interviendrait dans toutes dernières étapes du modèle relatif à la théorie de la charge résiduelle.

II.2 Particularité accessibilité à une large distribution d’états de charge

            L’électrospray est une technique permettant d’observer les ions d’une même molécule à divers états de charge. Cette distribution résulte notamment du solvant utilisé (ions préformés en solution), de la ou des conformation(s) adoptées par la molécule, et du processus d’ionisation/désorption des molécules analysées (conditions de désolvatation plus ou moins douces).

            Selon le pH de la solution étudiée, les molécules seront plus ou moins chargées. Ce phénomène est d’autant plus visible lorsque l’on étudie des molécules repliées sur elles-mêmes, maintenues par des interactions non-covalentes, voire complexées à d’autres molécules. Quand la valeur du pH diminue, les interaction non-covalentes sont défavorisées, donc les molécules se déploient et sont capables de porter un plus grand nombre de charges[8],[9], plus de sites acides et basiques étant rendus accessibles. De plus, des conditions de bas pH augmentent le nombre de protons à la surface des gouttelettes lors du processus d’ionisation/désorption.

            De même, la nature du solvant influence l’état de conformation des molécules et donc l’accessibilité des sites susceptibles de porter une charge. Plus la part de solvant organique est grande dans le volume de solution étudiée, plus les molécules biologiques seront dénaturées. Plusieurs études effectuées sur des protéines démontrent cet état de fait[10],[11],[12].

            C’est au niveau du premier skimmer de la source électrospray que la molécule d’intérêt va acquérir son état de charge final. Au sein d’un agrégat molécules ionisées/solvant, elle aura plus ou moins de facilité à capter les charges. En arrivant au skimmer, les liaisons hydrogènes présentent entre l’ion d’intérêt et le solvant sont rompus. Lors de cette désolvatation, les charges vont se répartir entre ces deux entités (i.e., ion et solvant) selon leur affinité protonique (Schéma 1). Dans des conditions de désolvatation douce (faible différence de potentiel), les hauts états de charges seront favorisés. Au contraire, dans des conditions de désolvatation dures (la différence de potentiel plus élevée), les faibles états de charge seront observés. Ainsi, moduler la différence de potentiel permet de contrôler l’énergie interne des ions. Concernant la désolvatation des ions, un minimum d’énergie est requis. Or l’application d’un voltage élevé au skimmer peut induire des ruptures de liaisons covalentes. Un compromis s’impose donc entre désolvatations des ions et conservation de leur forme intacte. Il est parfois possible d’observer des agrégats ions/solvant[13] dans des conditions de faible voltage. Ceci met en évidence la capacité de la technique d’ionisation/désorption par électrospray de préserver des complexes fragiles.

schéma 1

Schéma 1: Représentation schématique des deux types de désolvatation (douce et dure) d’un agrégat chargé molécule/solvant. M représente l’espèce d’intérêt et S le solvant. Le cas présenté propose arbitrairement : AP(S)>AP([M+H]+ (AP affinité protonique)

            La température de la source détermine aussi en partie le nombre de charge porté par l’analyste. Une augmentation de température permet d’une part une meilleure désolvatation des agrégats chargés et des ions par évaporation thermique, donc permet de travailler à de faibles valeurs de voltage au skimmer. D’autre part, dans de telles conditions les liaisons non-covalentes inter et intra molécule(s) se rompent, ce qui libère des basiques, donc porteurs de charges[14],[15]

            Jusqu’à présent nous nous sommes limités à décrire la protonation des molécules étudiées. L’électrospray produit aussi des adduits cationiques et anioniques, permettant à des molécules ne possédant pas de site ionisable d’être ionisée. La production d’ions multichargés est l’un des atouts de l’électrospray car elle rend possible l’observation d’analyste de très haut poids moléculaire. Un calcul simple, la résolution du système d’équations (3), permet d’identifier les états de charge d’une même molécule.

equation 2 M = ix Mi-i

i : état de charge.

Mi : masse de la molécule chargé i.

Mi+1 : masse de la molécule chargée (i+1).

            Cependant, ce calcul devient obsolète si le spectre de masse est enregistré avec une résolution permettant l’observation des pics isotopiques du massif de l’état de charge considéré. En effet, pour une molécule monochargée, les pics isotopiques du massif correspondant sont espacés de 1 Th. Pour un état de charge n, les pics sont espacés de 1/n Th. D’autre part, des logiciels basés sur des algorithmes de déconvolution16 permettent de faire ce calcul de façon rapide, automatique, et de présenter le résultat obtenu sur le spectre analysé.

III – Limites de l’électrospray et solutions

            Les qualités physico-chimiques du (ou des) solvant(s) utilisé(s) déterminent en grande partie la qualité du spray (Tableau 1). Il est bien connu que les solvants organiques, le méthanol par exemple, permet d’obtenir un spray de meilleure qualité qu’avec l’eau. En effet, le méthanol est plus volatil que l’eau. Cette propriété est liée à la faible tension de surface de ce solvant organique, mais aussi à sa viscosité. La tension de surface caractérise la force de cohésion du solvant. Quant à la viscosité, lorsque sa valeur est faible, elle permet d’assurer un écoulement régulier et homogène du liquide. Par ailleurs, la capacité d’un solvant à séparer les charges électriques positives et négatives est directement reliée à la qualité de formation d’un aérosol dans un champ électrique. En conséquence, un solvant de constant diélectrique important sera un bon candidat.

Solvant Tension de surface γ

(en mN.m-1; à 25°C)

Viscosité η

(en Cp; à 25°C)

Constante diélectrique ε

(en C2.J.m-1; à 25°C)

Eau 72 0.9 78
Acétonitrile 28 0.4 36
Méthanol 22 0.5 33

Tableau 1 : Les paramètres de différents solvants

                        Dans le cas d’échantillons étudiés en milieux aqueux, l’utilisation d’un gaz de nébulisation (azote) arrivant de façon coaxiale à l’aiguille d’injection facilite la nébulisation de l’échantillon (Figure 4). Une telle géométrie permet d’augmenter le débit d’injection de l’échantillon facilitant, par exemple, le couplage de la source d’ions avec une chromatographie liquide. Cette assistance pneumatique a été introduite pour la première fois dans la source électrospray[16]. Actuellement, la majorité des sources commercialisées permettent l’utilisation de l’électrospray pur et de l’électrospray assisté pneumatiquement.

Schéma de l'aiguille d'introduction d'une source électrospray

Figure 4 : Schéma de l’aiguille d’introduction d’une source électrospray

            D’autre part, la qualité des profils caractérisant les spectres de masse enregistrés en ESI est limitée par des paramètres propres aux analyseurs couplés à la source. Ils interviennent sur la sensibilité, la résolution, la gamme de masse accessible, la précision en masse. Il faut noter que la qualité d’un spectre électrospray dépend aussi de la stabilité du débit, les conditions extérieures, les paramètres d’un appareil à l’autre.

[1] Yamashita, M. and J.B. Fenn. 1984. Electrospray ion-source—another variation on the free-jet theme. J. Phys. Chem. 88:4451-4459.

[2] Edmond de Hoffman; Vincent Stroobant (2001). Mass Spectrometry: Principles and Applications (2nd ed. ed.). John Wiley and Sons

[3] Irina Manisali, David D.Y. Chen, Bradley B. Schneider Electrospray ionization source geometry for mass spectrometry:

past, present, and future Trends in Analytical Chemistry, Vol. 25, No. 3, 2006

[4] Malcolm Dole, L. L. Mack, R. L. Hines, R. C. Mobley, L. D. Ferguson, and M. B. Alice Molecular Beams of Macroions J. Chem. Phys. 49, 2240 (1968)

[5] Iribarne, J. V.; Thomson, B. A. On the evaporation of small ions from charged droplets Journal of Chemical Physics, Volume 64, Issue 6, pp. 2287-2294 (1976).

[6] Siu k. w. m. ; Guevremont r. ; le Blanc j. c. y. ; O’brien r. t. ;Berman s. s. ; Is droplet evaporation crucial in the mechanism of electrospray mass spectrometry? Organic mass spectrometry 993, vol. 28, no5, pp. 579-584

[7] Paul Kebarle and Michael Peschke, On the mechanisms by which the charged droplets produced by electrospray lead to gas phase ions Analytica Chimica Acta Volume 406, Issue 1, 1 February 2000, Pages 11-35

[8] Swapan K. Chowdhury, Viswanatham Katta, and Brian T. Chait Probing Conformational Changes in Proteins by Mass

Spectrometry Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9012

[9]   1. Lars Konermann, D. J. Douglas Equilibrium unfolding of proteins monitored by electrospray ionization mass spectrometry: distinguishing two-state from multi-state transitions, Rapid Communications in Mass Spectrometry

Volume 12, Issue 8, pages 435–442, 30 April 1998

[10] Carol V. Robinson, Evonne W. Chung, Birthe B. Kragelund, Jens Knudsen, Robin T. Aplin, Flemming M. Poulsen, and Christopher M. Dobson Probing the Nature of Noncovalent Interactions by Mass Spectrometry. A Study of Protein−CoA Ligand Binding and Assembly J. Am. Chem. Soc., 1996, 118 (36), pp 8646–8653.

[11] Kodali Ravindra Babua, Annie Moradiana and D. J. Douglas The methanol-induced conformational transitions of β-lactoglobulin, cytochrome c, and ubiquitin at low pH: a study by electrospray ionization mass spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry Volume 12, Issue 3, March 2001, Pages 317-328

[12] Samalikova M, Grandori R. Testing the role of solvent surface tension in protein ionization by electrospray. J Mass Spectrom. 2005 Apr;40(4):503-10.

[13] Sébastien Guillaumonta, Jeanine Tortajadaa, Jean-Yves Salpina, and Al Mokhtar Lamsabhib Experimental and computational study of the gas-phase interactions between lead(II) ions and two pyrimidic nucleobases: Uracil and thymine International Journal of Mass Spectrometry Volume 243, Issue 3, 1 June 2005, Pages 279-293

[14] le Blanc j. C. Y.; Beuchemin d; siu k. W. M. ; Guevremont r. ; Berman s. S. ; hermal denaturation of some proteins and its effect on their electrospray mass spectra Organic mass spectrometry 991, vol. 26, no10, pp. 831-839

[15] Matthias Mann, Chin Kai Meng, John B. Fenn, Interpreting mass spectra of multiply charged ions Anal. Chem., 1989, 61 (15), pp 1702–1708

[16] Andries P. Bruins, Thomas R. Covey, Jack D. Henion Ion spray interface for combined liquid  chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometry Anal. Chem., 1987, 59 (22), pp 2642–2646

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