La spectrométrie de masse appliquée à l’antidopage

Application de la spectrométrie de masse dans le domaine antidopage

À l’origine, la lutte antidopage était principalement menée par le comité olympique. C’est en 1999 qu’a été mise en place l’Agence mondiale antidopage (Word Anti-Doping Agency WADA). Cet organisme international est reconnu par toutes les associations sportives. On compte actuellement trente-quatre (34) laboratoires accrédités par WADA dans le monde habiletés à effectuer des analyses d’échantillons de contrôle du dopage. De nombreux autres laboratoires ont exprimé leur intérêt d’entamer le processus d’accréditation de WADA.

L’une des difficultés d’analyses antidopage réside dans l’identification d’une molécule parmi de nombreuses molécules, et la molécule en question se trouve très souvent en faible quantité voire à la limite de détection. Il est donc nécessaire de disposer de puissants détecteurs, hors avant l’application de la spectrométrie de masse, on disposait très peu de technique puissante et fiable. Le contrôle du produit dopant n’était pas sur, même si la liste de produits interdits est très limité, et les méthodes de dopage ne sont pas sophistiquées. Des avancées spectaculaires ont été réalisées ces 30 dernières années dans les techniques de détection, mais en même temps le dopage est évolué, en 40 ans on voir la liste de produit interdit est multipliée par 10. Si autre fois, avant les années 1970 on se dopait avec des composés exogènes, principalement des composés donc le poids moléculaire est compris entre 200-500 Da comme la morphine, l’amphétamine… ces composés ne sont pas produits par le corps humain. Avec des techniques de détection modernes, il est facile de les détecter. De nos jours, on se dope avec les molécules endogènes, qu’ils sont aussi produits par notre corps comme la testostérone ou hormone de croissance… qui complique la détection, notamment la difficulté de distinguer des molécules produites par notre corps et celles introduites de façons volontaire ou involontaire.

Depuis les Jeux Olympiques 1972 à Munich, la spectrométrie de masse a été introduite comme un outil dans la lutte contre le dopage[1] (figure 1). La GC couplée à cette dernière est rapidement devenue l’outil analytique de choix pour les analyses antidopage. Aujourd’hui, la spectrométrie de masse est devenue indispensable pour le contrôle antidopage, elle joue un rôle décisif tant pour l’efficacité des essais et de la sécurité juridique des athlètes. Cette technique a rapidement évolué vers un vaste champ d’application de par son couplage à la spectrométrie de masse en mode tandem (MS/MS), à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et à la spectrométrie de masse de rapports isotopiques (IRMS). Les techniques d’ionisation à pression atmosphérique ont été développées à partir des années 80 offrent la possibilité de coupler la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse. Ce couplage a permis d’élargir le domaine de spectrométrie de masse dans la lutte contre le dopage, il permet d’analyser des molécules non volatiles, thermolabiles. Les nouvelles sources d’ionisation comme l’électrospray permettent aussi d’accéder à plus grosses molécules comme des protéines entières. Dès lors, des méthodes impliquant la spectrométrie de masse n’ont cessé d’évoluer pour être plus sensibles et plus sélectives afin de détecter un nombre d’agents dopants qui est de plus en plus important et en très faible concentration.

spectromètre de masse antidopage

Figure 1 : Le dispositif utilisé pour le contrôle antidopage à Munich en 1972, ce dispositif comprend une chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse à secteur magnétique.

Protocole de collection des échantillons

Chaque échantillon recueilli est séparé en deux portions, la première portion est utilisée pour le dépistage ou criblage et pour la procédure de confirmation. Si une substance, ou une méthode interdite est trouvée, le deuxième échantillon peut être utilisé dans le cas de contre-expertise. La procédure d’analyse du premier échantillon sert à détecter la présence de substances interdites ou de leur(s) métabolite(s) associé(s), ou de marqueurs de d’une substance ou d’une méthode interdite. Le criblage ou profilage doit permettre la détection le maximum de composés dans une matrice complexe. Cette étape doit rapide, sélective et sensible afin de détecter les composés dans un temps limité, en effet lors de la compétition le temps entre deux compétitions pour un athlète peut être très court. Afin d’éviter les faux positifs, si une substance interdite est trouvée, une procédure de confirmation est effectuée pour recueillir des données complémentaires. Les analyses de confirmation doivent être autant ou plus sélectives que les procédures d’analyse initiale et sont effectuées à partir d’une nouvelle aliquote du premier échantillon.

La préparation des échantillons

La procédure de préparation des échantillons est similaire à celle pour les métabolistes qui est présentée dans le chapitre « métabolomiques », car en général, la recherche de substances interdites consiste à analyser les métabolistes. Pour lesquelles, la dilution est une solution simple, elle permet de détecter tous les composés possibles. Mais l’extraction et la préconcentration restent une étape importante pour concentrer les composés qui sont souvent à très faible concentration.

Injection diluée

Grâce à des progrès technologie, les méthodes de séparation sont de plus en plus performantes et les spectromètres de masse très sensibles et rapides. La méthode de simple dilution de l’échantillon urinaire avant injection dans la LC-MS est de plus en plus utilisée pour l’analyse de produits dopants[2]. Les échantillons urinaires sont simplement dilués avec de l’eau ultra pure ou une solution appropriée et puis passés à la LC-MS. L’injection des échantillons sont automatisée permettant de passer un grand nombre d’échantillons. La dilution est une méthode de choix pour les analyses rapides multi-analytes, car elle nécessite peu de temps pour le traitement d’un grand nombre d’échantillons[3][4]. De plus, cette approche permet une meilleure répétabilité des temps de rétention en comparaison avec les méthodes d’extraction et préconcentration. Par contre, un grand nombre de composés détectés surtout la matrice peut compliquer l’interprétation de résultats, et certaines substances peuvent être masquées par cette méthode.

Le couplage de la chromatographie en phase gazeuse (GC) et spectrométrie de masse

Le couplage de la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse est une technique utilisée depuis de nombreuses années. Pour ce fait l’échantillon doit être en phase gazeuse, puis le mélange de molécules est poussé par un gaz, le plus souvent c’est l’azote à pression élevée, à travers la colonne qui sépare les molécules en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques. La source d’ionisation utilisée pour le couplage GC/MS est l’impact électronique, qui exige les molécules thermostables et volatiles. Cette source d’ionisation est très énergétique, permettant de fragmenter les molécules en les ionisants, dès lors chaque molécule analysée par cette source d’ions donne un spectre de masse caractéristique contenant l’ion moléculaire (pas toujours) et surtout des ions fragments (figure 2). L’avantage de cette source d’ionisation est la reproductibilité, quelques soit l’appareil utilisé, on obtient les mêmes spectres de masse pour une molécule donnée, cela permet l’identification basée sur des librairies est très fiable.

sm_cyclohexanone

Figure 2 : Spectre de masse à impact ionisation de cyclohexanone dont la masse de l’ion moléculaire est de 96. L’ion moléculaire est accompagné par des ions fragments qui caractérisent le spectre de masse de la molécule.

Le couplage de la chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse.

Les techniques d’ionisation à pression atmosphérique rendent le couplage de la chromatographie en phase liquide (LC) et la spectrométrie de masse possible. La LC/MS est une technique très utilisée dans le domaine bioanalytique parce qu’elle permet d’analyser les composés non volatils, thermolabiles ou de hauts poids moléculaires, ne nécessitant ni étape d’hydrolyse, ni de dérivation préalable. La LC présente une sélectivité supérieure a la GC de par le fait que les interactions sont plus puissantes et efficaces en phase liquide, entre les analystes avec la phase stationnaire ainsi que la phase mobile. Il existe un grand nombre de phases stationnaires et diverses possibilités de phases mobiles.

Les analyses antidopage effectuées par LC couplée à un détecteur ultra-violet (LC-UV), ne présentent pas une sélectivité suffisante en comparaison avec la GC-MS[5]. C’est grâce au développement des sources d’ionisation à pression atmosphérique (API) que la LC a pu être facilement couplée à la MS, permettant l’application de cette technique très performante à l’analyse antidopage. Les sources API comprennent l’ESI, l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI). Ces trois sources sont facilement couplées à la LC et présentent des domaines d’application distincts et complémentaires. Pour l’ionisation de composés plus apolaires, la source APCI est souvent sélectionnée, alors que la source APPI est moins utilisée dans le domaine bioanalytique, mais elle reste une alternative à l’APCI. Ces dernières techniques sont des techniques d’ionisation douces permettent d’obtenir des signaux MS stables, ainsi qu’une réduction des effets matrice, et sont donc des options très intéressantes. L’ESI est la source la plus utilisée car elle permet l’ionisation d’analytes sur une large gamme de masses en mode positif et négatif, ainsi qu’une excellente sensibilité. Le mécanisme de l’ESI consiste en l’application d’une différence de potentiel comprise entre 0 et 6 kV à la sortie de la LC ce qui provoque la formation d’un spray[6]. Dans certains cas, un gaz de nébulisation est ajouté pour faciliter la formation de l’aérosol. Le principe de l’ESI repose sur la formation des gouttelettes chargées, qui au fur et à mesure explose par la tension de surface à cause de la répulsion coulombienne et la chaleur. Ce processus se répète jusqu’à ce que les gouttelettes soient devenues des ions accompagnés par des molécules de solvant.

Le couplage d’électrophorèse (CE) et l’analyse de protéines

Pour pouvoir analyser les échantillons contenants de protéines, il est essentiel de séparer les protéines de la matrice. La précipitation de protéines est une étape simple et rapide, elle permet de séparer les protéines de la matrice sanguine avant de passer le système GC/MS ou LC/MS. Une simple dilution sanguine dans un solvant apolaire, (la plus souvent c’est l’acétonitrile) puis passer à la centrifugeuse permet de séparer les protéines de la matrice. L’élimination des protéines est essentielle avant l’analyse par GC-MS ou LC-MS/MS pour éviter l’obstruction irréversible des colonnes chromatographiques, et surtout d’éviter la perte d’échantillon en cours d’analyse. Afin d’analyser un grand nombre d’échantillons en parallèle, et pour automatiser la procédure, des plaques de précipitation de protéines sont disponibles. Ces plaques présentent de nombreux avantages dont la possibilité d’éviter les étapes de transfert des échantillons, puisque la filtration peut être effectuée directement dans le même puits que l’étape de précipitation[7]. Pour détecter et identifier les protéines, l’électrophorèse est une méthode de choix. En 2004, lors des jeux olympiques d’Athènes, le couplage d’électrophorèse à la spectrométrie de masse (CE/MS) est appliqué en grande échelle pour des analyses d’hormone de croissance administrée illégalement chez athlètes.

Le dépistage de la testostérone

La testostérone (T) est une hormone sexuelle synthétisée par l’organisme à partir du cholestérol. Elle est éliminée dans l’urine avec d’autres métabolites, dont un de ses isomères, est l’épitestostérone (E). Lors d’un dopage à la testostérone, le rapport testostérone/épitestostérone (T/E) augmente. Le Comité International Olympique reconnaît actuellement comme méthode de détection du dopage par la testostérone, l’étude du rapport T/E. Cependant, dans certains cas, l’administration de testostérone demeure difficile à établir avec certitude par cette méthode.

Les contrôles antidopages en vue de détecter la testostérone, sont effectués en deux étapes, une première étape dite de criblage, une deuxième étape de confirmation.  Lors de la première étape, le diagnostic de la prise de testostérone se fait à partir du rapport Testostérone/Epitestostérone (rapport T/E). Le test de dépistage s’effectuera par la technique de couplage de la chromatographie gazeuse et de la spectrométrie de masse : on mesure le rapport des hauteurs ou des aires des pics moléculaires de la testostérone et de l’épitestostérone.

Rapport Testostérone/Epitestostérone

La testostérone et l’épitestostérone font partie d’une catégorie particulière d’isomères appelée stéréoisomères ou stéréomères. On parle d’isomérie lorsque deux molécules possèdent la même formule brute mais ont des structures différentes. Ces molécules, appelées isomère, ont des mêmes masses moléculaires mais leurs propriétés physico-chimiques et biologiques sont différentes. Les épimères sont des stéréoisomères organiques qui ne diffèrent entre eux que par la configuration d’un seul et unique carbone asymétrique. L’épitestostérone est un épimère de la testostérone. La testostérone (I) et l’épitestostérone (II) sont des épimères qui ne diffèrent l’une de l’autre que par la configuration de l’atome de carbone portant sur le groupe OH. Ces isomères ont exactement la même masse moléculaire, par contre, leurs propriétés physico-chimiques sont légèrement différents, par conséquent, lors de passages à la colonne GC, leurs temps de rétention sont  différents.

testostérone

Figure 3 : Structure de la testostérone (I) et épitestostérone (II)

Le critère de positivité du test de détection de la testostérone a été établi par L’agence Mondiale antidopage (AMA). Un rapport testostérone/épitestostérone (T/E) supérieur à 6 était  considéré comme suspect d’une prise exogène de testostérone, maintenant ce rapport est fixé à 4. Mais la fiabilité de ce test de détection est controversée. En effet, le rapport T/E varie selon les individus, par exemple le rapport T/E est de 0,5 pour un Asiatique, et 1,25 pour un Caucasiens. Des tests peuvent se révéler faux positifs chez des sujets dont le rapport T/E est naturellement au-dessus de la valeur seuil. A contrario, des tests faussement négatifs peuvent se voir chez des sujets prenant de faibles doses de testostérone. D’autre part, l’épitestostérone n’est pas considérée comme un produit dopant. Il suffit au sportif d’en prendre pour ajuster le rapport T/E afin de le rendre inférieur à 4. Par ailleurs, la consommation de boissons en grande quantité avant un contrôle antidopage dilue les urines et rend l’épitestostérone non mesurable lors du test. La prise de produits masquants comme l’éthanol présent dans l’alcool de DHEA ou d’androstenedione peut également modifier le rapport T/E. Le rapport T/E n’est pas une preuve suffisant pour confirmer la positivité. En cas de valeur du rapport T/E supérieur à 4, des examens complémentaires doivent être réalisés (sauf dans les cas où il est prouvé que cette valeur est physiologique). Malgré les nombreux biais liés à la mesure de ce rapport T/E rendant ce test peu fiable, l’agence mondiale antidopage a tenu à le maintenir en raison d’un coût moindre que celui d’autres techniques plus fiables mais plus coûteuses.

La spectrométrie de masse à rapport isotopique

Cette méthode appelée IRMS, est appliquée lorsque le rapport T/E est supérieur à 4, mais aussi, notamment, lorsque la concentration des 2 substances dépasse 200 ng/mL afin d’éviter une consommation d’épitestostérone pour rendre le rapport T/E inférieur à 4. La spectrométrie de masse à rapport isotopique (IRMS) est l’une des techniques les plus performantes pour la détermination précise des rapports isotopiques. Elle permet entre autres, la détermination exacte de l’abondance isotopique d’un atome de carbone. Ce type d’analyse se base sur le constat que la proportion de carbone 13 entre une source de carbone inorganique et organique peut différer.

Le principe de l’IRMS est de mesurer des abondances isotopiques d’atomes stables (13C/12C) après séparation par chromatographie en phase gazeuse et combustion des composés. Les variations isotopiques naturelles en carbone sont relativement faibles. La grande majorité des sources de carbone étant appauvrie en 13C par rapport à une valeur de référence, des valeurs négatives de 13C °/°° sont généralement obtenues. Cette méthode est basée sur le fait que la testostérone exogène est fabriquée à partir de stérols de plantes à faible incorporation de carbone 13. Les stéroïdes endogènes, provenant du 13C que les ceux issus de l’hémi synthèse. Selon les critères de l’agence mondiale antidopage, la prise de stéroïdes exogènes est prouvée lorsque la valeur mesurée pour au moins un métabolite diffère d’au moins 3 unités pour mille du stéroïde de référence endogène sélectionnée. Cette mesure se fait grâce au CO2  produit par la pyrolyse de l’échantillon. La méthode GC-C-IRMS est bien plus que la mesure du rapport T/E dans la mesure où elle permet la détection spécifique de la prise de testostérone exogène. Par contre, elle est longue et difficile, et surtout elle consomme une grande quantité d’urine : entre 8 ml et 32 ml suivant le nombre de métabolites étudiés. En ajoutant les 15 ml nécessaires au test d’Érythropoïétine (EPO), il ne reste qu’une faible quantité pour les autres contrôles. Il est donc difficile de l’utiliser de manière routinière.

Détection de diurétiques

Les diurétiques sont des substances qui entraînent une augmentation de la sécrétion urinaire, ils sont utilisés chez les athlètes afin d’éliminer le maximum des substances administrées illégalement dans leurs urines[8]. Une nouvelle méthode de dépistage de contrôle du dopage pour l’analyse des diurétiques et des stimulants, en utilisant ultra high performance liquide chromatographie couplée à un spectromètre de masse très haute résolution (UHPLC-HRMS) a été développée. Le dépistage a été réalisé dans une seule analyse full MS, en alternant les polarités positive et négative, qui a permis de détecter plus de 120 analytes cibles. Les échantillons urinaires sont directement dilués 10 fois dans la solution étalon interne suivie par injection à UHPLC-HRMS. Le temps total pour chaque analyse est de 10 min. La validation du procédé a abouti à la limite de détection pour les diurétiques entre 25 et 250 ng/ml et de stimulants entre 5 et 500 ng/ml. La méthode de dépistage a été mise en œuvre dans la lutte contre le dopage de routine.

Hormones peptidiques

La sensibilité est le problème majeur pour la détection d’hormones peptidiques. Les hormones peptidiques sont généralement administrées à faibles doses et par conséquent, les concentrations dans le sang et l’urine sont très faibles (pg/ml). En général, ils sont détectés par des techniques immunologiques, mais les preuves scientifiques obtenues avec MS est préférables. Les laboratoires de contrôle antidopage ont réussi à développer des méthodes LC-MS pour confirmer la présence de ces peptides.

Détection de l’insuline

Différentes études ont été menées sur le développement d’une méthode d’extraction des analogues (similaire) de l’insuline en matrice urinaire et plasmatique pour des analyses par la spectrométrie de masse en tandem. Les travaux réalisés ont conduit à l’établissement d’un protocole pour l’analyse des analogues rapides de l’insuline en matrice urinaire et plasmatique en novembre 2010[9].

Tétracosactide

Tétracosactide est un analogue synthétique de la corticotrophine humaine (ACTH) qui stimule la libération de cortisol. La détection de synacthène a été décrite par Thevis et ses collaborateurs. Les échantillons de plasma sont purifiés en utilisant une chromatographie d’immuno-affinité et une extraction en phase solide. Les composés ont été séparés par LC en phase inversée couplée avec un spectromètre de masse en tandem[10]. La méthode développée nécessaire 2 mL de plasma pour une limite de détection de 100 fmoles/ml (300 pg / mL).

Les composés oxygénés à base d’hémoglobine

Les composés oxygénés à base d’hémoglobine sont utilisés comme transporteurs artificiels d’oxygènes. Ils peuvent être utilisés dans les sports d’endurance pour augmenter le transport d’oxygène. Un composé important de ce groupe est Hemopure. Hemopure est dérivé de l’hémoglobine bovine. Les hémoglobines de bovine et celles d’humaines diffèrent de 15% en séquence d’acides aminés et après digestion tryptique, des fragments spécifiques de l’espèce bovine sont sélectionnés comme composés cibles pour la détection LC-MS/MS.

[1] History of mass spectrometry at the Olympic Games Peter Hemmersbach1,2 JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY J. Mass Spectrom. 2008; 43: 839–853

[2] R. R. Ventura, M. Roig, N. Montfort, P. Sáez, R. Bergés and J. Segura, European Journal of Mass Spectrometry 2008, 14, 191.

[3] L. Politi, L. Morini and A. Polettini, Clinica Chimica Acta 2007, 386, 46-52.

[4] F. Marclay, E. Grata, L. Perrenoud and M. Saugy, Forensic Science International 2011, 213, 73-84.

[5] K. R. Mueller, J. Grosse, R. Lang and D. Thieme, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1995, 674, 1-11.

[6] Yamashita, M. and J.B. Fenn. 1984. Electrospray ion-source—another variation on the free-jet  theme. J. Phys. Chem. 88:4451-4459.

[7] P. L. Kole, G. Venkatesh, J. Kotecha and R. Sheshala, Biomedical Chromatography 2011, 25, 199-217.

[8] Development and validation of an open screening method for diuretics, stimulants and selected compounds in human urine by UHPLC–HRMS for doping control A. Jiménez Giróna,∗, K. Deventerb, K. Roelsb, P. Van Eenoob Analytica Chimica Acta 721 (2012) 137– 146

[9] Qualitative Determination of Synthetic Analogues of Insulin in Human Plasma by Immunoaffinity Purification and Liquid Chromatography−Tandem Mass Spectrometry for Doping Control Purposes Mario Thevis ,*† Andreas Thomas ,† Philippe Delahaut ,‡ Alain Bosseloir ,§ and Wilhelm Schänzer Anal. Chem., 2005, 77 (11), pp 3579–3585

[10] Determination of Synacthen in urine for sports drug testing by means of nano-ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry Volume 23, Issue 17 15 September 2009
Pages 2669–2674

 

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