Introduction à la spectrométrie de masse

mass spectrometryLa spectrométrie de masse est une technique permettant de déterminer la masse d’une molécule ou d’une association de molécules. Grâce à sa sensibilité (des limites de détection de l’ordre d’attomole sont souvent atteints), sa sélectivité et sa possibilité de faire des analyses quantitatives rapides, la spectrométrie de masse joue un rôle important dans plusieurs domaines, comme l’antidopage, la protéomique, la métabolomique, la médecine… Les spectromètres de masse sont de plus en plus performants, ils offrent de très haute résolution et des précisions en masse de l’ordre <1 ppm, permettant de proposer la composition élémentaire d’une molécule, d’une séquence peptidique, ou oligonucléotide… De plus la spectrométrie de masse en tandem, est un outil très efficace qui  offre  la possibilité de sonder la structure d’une molécule, et d’expliquer une rupture ou un arrangement d’une liaison en phase gazeuse.

Par spectrométrie de masse, on peut réaliser des analyses qualitatives et quantitatives. De plus, la possibilité de coupler avec les méthodes séparatives comme chromatographie en phase liquide ou gazeuse, augmente l’efficacité de cette dernière.

Brève histoire de la spectrométrie de masse

Le premier spectromètre de masse, J.J Phy. Mag 1897

Le premier spectromètre de masse, Thomson J.J Phy. Mag. 1897

1897 : L’histoire de la spectrométrie de masse a commencé avec Sir JJ Thomson, dont les études sur les décharges électriques dans les gaz conduisent à la découverte de l’électron en 1897. Dans la première décennie du 20e siècle, Thomson a construit le premier spectromètre de masse (alors appelé un spectrographe de parabole) pour déterminer des ratios d’ions de masse sur charge. Dans cet instrument, les ions qui sont générés dans des tubes à décharge passent à travers des champs électriques et magnétiques (analyseur à secteur magnétique simple focalisation). La trajectoire des ions est alors courbée plus ou moins suivant la masse sur charge de chaque ion. Les ions sont détectés sur un écran fluorescent ou d’une plaque photographique. Thomson a reçu 1906 prix Nobel de physique « en reconnaissance des grands mérites de ses recherches théoriques et expérimentales sur la conductivité de l’électricité des gaz. »

1918 : La source d’ions (impact électronique) est inventée par Dempster puis perfectionnée quelques années plus tard par Bleakney (1928). C’est la première source d’ions utilisée pour la spectrométrie de masse.

1930 : L’analyseur à secteur magnétique à double focalisation est inventé, il permet de corriger la dispersion en espace et énergie cinétique, donnant lieu à une meilleure résolution des spectres de masse.

1946 : Le concept de Time Of Flight (TOF) a été proposé par William E. Stephens. Dans un analyseur TOF, les ions sont séparés par des différences de vitesses. TOF/MS est rapide, il est applicable à la détection chromatographique, et il est maintenant beaucoup évolué et utilisé dans plusieurs domaines.

1950: Roland Gohlke et Fred McLafferty ont couplé la chromatographie gazeuse à la spectrométrie de masse  (GC-TOF/MS).

1955 : Paul présentait le principe de quadripôle, les ions peuvent être gardés captif dans le quadripôle ou être éjectés suivant le voltage appliqué aux électrodes. Ce principe a valu le prix Nobel et son application donne lieu aux analyseurs quadripôle, triples quadripôles, Ion Trap qui sont encore beaucoup utilisés dans le domaine de spectrométrie de masse.

1966 : Invention de la source d’ions Ionisation Chimique (CI) par Field, cette source est moins énergétique par rapport à Impact électronique. Elle permet de mieux préserver les ions pseudo moléculaire. L’ionisation chimique a été observée par Thomson en 1913, mais à cette époque, il n’a pas compris le phénomène.

1968 : Introduction de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) par Keith R. Jennings et McLafferty. La fragmentation des ions précurseurs est effectuée par les collisions avec des gaz neutres (Collision Induced Dissociation (CID)).

1974 : Le FT-ICR/MS : Melvin B. Comisarow and Alan G. Marshall ont introduit l’opération de la transformée de Fourier au traitement des signaux électriques, qui sont générés par les ions dans un spectromètre de masse Ion Cyclontron Resonance (ICR-MS). Ce traitement donne lieu à des spectres de masse ultra haute résolution.

1985 : La source Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) a été développée par le professeur de biophysique Franz Hillenkamp et Michael Karas. Cette source est douce et très sensible, elle permet d’analyser les molécules bios organiques.

1988 : La source d’ions électrospray est inventée par John Fenn qui lui a valu un prix Nobel. Cette source a donné une nouvelle dimension à la spectrométrie de masse. Cette source est très sensible, facile à utiliser, c’est une source d’ionisation douce, elle permet de préserver les ions pseudo moléculaires. Le couplage de la chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse est facilement maitrisé avec cette source d’ions (LC-MS). Les ions formés par cette source peuvent être multichargés, par conséquent la gamme de m/z est réduite considérablement, permettant d’analyser les grosses molécules tout en ayant une bonne résolution.

2005 : La commercialisation du premier spectromètre de masse à analyseur Orbitrap (LTQ-Orbitrap-XL), une révolution de la spectrométrie de masse. Les spectromètres de masse type Orbitrap sont des appareils très hauts performance, notamment la haute résolution, la vitesse de scan rapide, la sensibilité, la mesure de masse précise, la robustesse. De plus, ils sont faciles à utiliser, permettant d’éviter les erreurs d’interprétation des spectres de masse (ou éviter les tricheries), causées par nombreux paramètres de l’appareil.

La suite : L’amélioration des analyseurs, les sources d’ions. A continuer

Structure d’un spectromètre de masse

Un spectromètre de masse comporte 3 parties.

  • Une source d’ion, où les ions sont produits en phase gazeuse à partir des états solides, liquides ou gazeux.
  • Un ou plusieurs analyseurs dans lequel les ions sont manipulés (transportés, tournés, triés, sélectionnés, fragmentés…).
  • Un détecteur qui compte des ions et amplifie leurs signaux ou enregistre l’image d’un courant induit par le mouvement des ions.

Enfin un système informatique qui collecte toutes les données à partir de ces trois éléments pour générer un spectre de masse.

Schéma d’un spectromètre de masse

Schéma d'un spectromètre de masse

Détecteur

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Détecteur destructif

Détecteur FT

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spectrométrie de masse ligne 2Caractéristiques d’un spectromètre de masse

La resolution

La capacité à séparer deux pics adjacents (Figure 1), elle est mesurée soit au pied du pic soit à mi-hauteur de pic. Dans tous les spectromètres de masse, la résolution est diminuée quand le rapport de masse sur charge (m/z) augmente. La diminution est plus ou moins rapide selon le type de l’appareil, par exemple, pour les spectromètres de masse à transformée Fourier, elle décroît de façon exponentielle en fonction du m/z, mais pour un spectromètre de masse à analyseur Time of Flight (TOF) elle diminue linéairement. Selon le type d’appareils, la résolution est de quelques milliers pour les spectromètres de masse à basse résolution (piège ionique, quadripôle) à quelques centaines de milliers pour les spectromètres de masse à très haute résolution (Orbitrap, FT-ICT).

la résolution spectrométrie de masseFigure 1 : Illustration de la résolution pour un ion 4 fois chargés. à basse résolution, les pics sont chevauchés.

La vitesse d’analyse (scan rate)

Elle est exprimée en Hz c’est-à-dire le nombre de spectre que le spectromètre de masse peut effectuer en une seconde. Pour une expérience en infusion directe en spectrométrie de masse, la vitesse d’analyse n’a pas beaucoup d’importance, la plupart du temps l’utilisateur ne voit pas vraiment la différence de vitesse d’analyse entre les appareils. Mais elle est très importante pour le couplage avec la chromatographie pour les échantillons très chargées comme les échantillons en biologie. Par exemple, pour une analyse protéomique, la solution peut contenir des centaines de milliers molécules, pour des appareils dont la vitesse d’analyse est de l’ordre 1Hz (une seconde par analyse) ce n’est pas suffisant. Dans ce cas il faut des appareils ayant une vitesse d’analyse de l’ordre de dizaine Hz.

La précision en masse

Elle est exprimée en ppm (partie par million), elle est importante pour déterminer et identifier les molécules, de plus pour les appareils possédants une très grande précision en masse (de l’ordre de quelques ppm), ils peuvent proposer les formules brutes exploitables pour les molécules inconnues (Figure 2). La bonne résolution est un critère important pour avoir la bonne précision mais ce n’est pas tout, la précision est dépendante de nombreux facteurs comme la stabilité de l’appareil, la température, les conditions de calibration interne et externe, les équations mathématiques.

mesure précise spectrométrie de masseFigure 2: Nombre de formules brutes en fonction de l’erreur de masse, plus celle-ci est faible moins le nombre de compositions élémentaires proposées par le logiciel.

La gamme de masse

L’écart entre le plus petit m/z et le plus grand m/z effectué en une analyse, à faire très attention, car certains appareils laissent choisir une large gamme de masses, mais dans cette gamme de masses l’optimisation de certaines populations m/z ne sont pas la même.

La sensibilité

La sensibilité est l’un des points forts de la spectrométrie de masse, de nos jours, les appareils sont capables d’analyser des quantités de quelques attomoles.

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